問清江，慕 娟，孫曉宇，丁 浩

(陜西省微生物研究所， 陜西 西安 710043)

右旋糖酐酶(Dextranase，EC 3.2.1.11)屬于糖苷水解酶，專一性裂解右旋糖酐(Dextran)分子中的α-1,6葡萄糖苷鍵，使右旋糖酐分子降解為小分子的右旋糖酐、異麥芽糖、異麥芽三糖、葡萄糖及少量的多聚糖。右旋糖酐酶可用于醫(yī)藥工業(yè)和食品工業(yè)，防治齲齒，酶解高分子右旋糖酐制造血漿代用品，在甘蔗制糖業(yè)中處理微生物發(fā)酵產(chǎn)生的大分子右旋糖酐而降低黏度增蔗糖產(chǎn)率[1～3]。右旋糖酐(Dextran)是主要由葡萄糖α-1,6糖苷鍵連接而成的葡聚糖。是世界上第一個(gè)工業(yè)化生產(chǎn)的微生物多糖，也是美國FDA批準(zhǔn)的第一種可用于食品和藥品的微生物胞外多糖。由腸膜狀明串珠菌(Leuconstocmesenteriodes)產(chǎn)生的右旋糖酐蔗糖酶合成的右旋糖酐含有95%的α-(1,6)糖苷鍵，同時(shí)含有少量其它糖苷鍵的分支結(jié)構(gòu)[4]。右旋糖酐具有安全、無毒等多種優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等多個(gè)領(lǐng)域。臨床上應(yīng)用的常有3種規(guī)格產(chǎn)品：右旋糖酐70、右旋糖酐40、右旋糖酐20，是目前公認(rèn)的優(yōu)良血漿代用品之一。具有增加血容量、改善微循環(huán)、防止彌散性血管內(nèi)凝血的作用，主要用于治療失血性休克[5]。藥用右旋糖酐傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝是鹽酸水解高分子右旋糖酐得到不同分子量的右旋糖酐，水解效率低，而且引入氯離子產(chǎn)生大量的氯化物嚴(yán)重影響了右旋糖酐產(chǎn)品質(zhì)量，容易產(chǎn)生不良反應(yīng)。采用右旋糖酐酶水解右旋糖酐，專一性提高水解效率，水解條件溫和，減少氯化物對產(chǎn)品品質(zhì)的不良影響。對右旋糖酐酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究，為右旋糖酐的酶水解前期探究和技術(shù)儲備。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 右旋糖酐酶(寧夏夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)。

1.1.2 右旋糖酐(自制)。

1.1.3 試劑 葡萄糖, Sigma公司產(chǎn)品；3, -二硝基水楊酸(DNS),化學(xué)純；其他試劑為市售分析純。

1.1.4 儀器 752分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；HH-4A電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 右旋糖酐酶的最適反應(yīng)溫度 適當(dāng)稀釋酶液，分別在40、45、50、55、60、65℃反應(yīng)溫度下測定右旋糖酐酶活力，繪制最適溫度曲線確定最適反應(yīng)溫度。

1.2.2 右旋糖酐酶的最適反應(yīng)pH 分別用pH 3.0、3.6、4.0、4.6、5.0、5.6、6.0緩沖液適當(dāng)稀釋酶液，并在相對應(yīng)不同pH值條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)，測定右旋糖酐酶活力，繪制最適pH曲線確定最適反應(yīng)pH。

1.2.3 右旋糖酐酶的最適反應(yīng)底物濃度 分別在右旋糖酐濃度0.2%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)，測定右旋糖酐酶活力，繪制底物濃度曲線確定最適反應(yīng)底物低濃度。

1.2.4 右旋糖酐酶的熱穩(wěn)定性 酶液分別在45、50、55、60、65℃下放置1 h，每隔10 min取樣測定其殘余活力，繪制右旋糖酐酶熱穩(wěn)定性曲線。

1.2.5 右旋糖酐酶的酸堿穩(wěn)定性 分別用pH2.2、3.0、5.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、9.6 、10.0的緩沖液適當(dāng)稀釋酶液，4℃放置24 h，測定其殘余酶活，繪制右旋糖酐酶酸堿穩(wěn)定性曲線。

1.2.6 金屬離子對右旋糖酐酶活力的影響 在適當(dāng)稀釋的酶液中分別加入Mn2+、 Ba2+、Zn2+、Cu2+、Ca2+、Fe3+、Mg2+，使酶促反應(yīng)體系中金屬離子濃度為5 mmol·L-1，測定右旋糖酐酶活力。

1.2.7 右旋糖酐酶底物特異性 分別以重均分子量T-10、T-40、T-70、T-500、T-1000、T-10000的右旋糖酐為底物進(jìn)行酶促反應(yīng)，測定右旋糖酐酶活力。

1.2.8 右旋糖酐酶活力的測定 采用DNS法測定右旋糖酐酶活力。配制1 mg·mL-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別量取0.3、0.35、0.4、0.45、0.5 mL果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，用蒸餾水補(bǔ)齊1 mL，再加入2mLDNS，沸水浴2 min，流水冷卻后加蒸餾水至10 mL，在540 nm測定光吸收值，繪制葡萄糖糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程用于葡萄糖和右旋糖酐酶活力測定。將酶液用一定pH值的緩沖液適當(dāng)稀釋后，取0.5 mL的酶液加入到0.5 mL1%的右旋糖酐溶液中，50℃準(zhǔn)確反應(yīng)10 min，加入2 mLDNS終止反應(yīng)，沸水浴2 min顯色，然后流水冷卻至室溫，定容至10 mL；空白對照，0.5 mL1%的右旋糖酐溶液50℃準(zhǔn)確反應(yīng)10 min，先后加入2 mLDNS和0.5 mL的酶液，沸水浴2 min顯色，然后流水冷卻至室溫，定容至10 mL。以蒸餾水為對照測定540 nm的吸光值，樣品和空白對照的吸光值之差根據(jù)回歸方程得出反應(yīng)液中的葡萄糖量，從而確定酶活。酶活力單位定義：在上述條件下，每分鐘催化右旋糖酐產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需要的酶量定義為1個(gè)酶活力單位(IU)。

2 結(jié)果與分析

2.1 右旋糖酐酶的最適反應(yīng)溫度

圖1溫度對右旋糖酐酶反應(yīng)的影響

在40、45、50、55、60、65℃不同溫度條件下進(jìn)行酶促反應(yīng),檢測右旋糖酐酶活力，結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，隨著溫度的升高，由于反應(yīng)速率的提高，右旋糖酐酶活力呈現(xiàn)增加趨勢，55℃時(shí)酶活力最高；隨后右旋糖酐酶活力出現(xiàn)降低趨勢，與酶的熱穩(wěn)定性有關(guān)。該右旋糖酐酶的最適反應(yīng)溫度為55℃。

2.2 右旋糖酐酶的最適反應(yīng)pH

在pH 3.0、3.6、4.0、4.6、5.0、5.6、6.0不同pH條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)，檢測右旋糖酐酶活力，結(jié)果見圖5。隨著pH值的升高，右旋糖酐酶活力呈現(xiàn)增加趨勢，pH 5.0時(shí)酶活力最高；隨后右旋糖酐酶活力出現(xiàn)降低趨勢。該右旋糖酐蔗糖酶的最適反應(yīng)溫度為pH 5.0。

圖2pH對右旋糖酐酶反應(yīng)的影響

2.3 右旋糖酐酶的最適反應(yīng)底物濃度

圖3底物濃度對右旋糖酐酶作用的影響

以不同濃度的右旋糖酐為底物進(jìn)行右旋糖酐酶的酶促反應(yīng)，結(jié)果見圖3。隨著右旋糖酐濃度的增加，右旋糖酐酶的活力增加，當(dāng)右旋糖酐的濃度為2%時(shí)，酶的活力最高，隨后底物濃度繼續(xù)增加，而酶的活力降低。所以右旋糖酐酶水解右旋糖酐的最適底物濃度為2%。

2.4 右旋糖酐酶的熱穩(wěn)定性

酶液分別在45、50、55、60、65℃下放置1h，每隔10 min取樣測定其殘余活力，未經(jīng)處理酶活力為100%，不同溫度條件下，相對酶活隨時(shí)間變化見圖4。45℃和50℃條件下，1h右旋糖酐酶活力損失不大，相對酶活分別為98%和93%；55℃時(shí)，1 h右旋糖酐酶相對酶活下降到76%；60℃時(shí)，30 min時(shí)酶活力急劇下降到45%，1 h右旋糖酐酶相對酶活下降到29%；65℃時(shí)，20 min時(shí)酶活力急劇下降到27%。該右旋糖酐酶在50℃以下相對穩(wěn)定。

圖4右旋糖酐酶的熱穩(wěn)定性

2.5 右旋糖酐酶的酸堿穩(wěn)定性

圖5右旋糖酐酶的酸堿穩(wěn)定性

將右旋糖酐酶酶液用不同pH緩沖液適當(dāng)稀釋，4℃放置24 h，測定其殘余酶活力，結(jié)果見圖5。酶液于pH8.0處理24 h，檢測出的酶活力最高，殘余酶活92%；pH 2.2殘余酶活64%以上； pH 9.6殘余酶活74%以上，之后右旋糖酐酶活力急速下降，pH 10.0殘余酶活僅剩19%。結(jié)果說明，右旋糖酐酶在pH 2.2～9.6范圍內(nèi)相對穩(wěn)定，具有較好的酸堿穩(wěn)定性，在右旋糖酐酶的應(yīng)用中具有相對寬泛的pH范圍。

2.6 右旋糖酐酶底物特異性

以不同分子量的右旋糖酐作為底物進(jìn)行右旋糖酐酶的酶促反應(yīng)，結(jié)果見圖6。隨著分子量的增大，右旋糖酐酶活力增加，也就是酶的親和力隨底物分子量的增加而增強(qiáng)。T-10最小，T-40 和T-70相近，隨后繼續(xù)增大，T-10 000親和力最大，大大高于T-1 000。右旋糖酐分子量的增大，單個(gè)葡聚糖分子的空間體積會上升，與酶蛋白分子結(jié)合的幾率會增加，同時(shí)單個(gè)底物分子可進(jìn)行切割的位點(diǎn)相應(yīng)增加也會提高酶促反應(yīng)的效率。這樣有利于右旋糖酐酶降解制備低分子量的右旋糖酐產(chǎn)品。

圖6右旋糖酐酶底物特異性

2.7 金屬離子對右旋糖酐蔗糖酶活力的影響

不同金屬離子對右旋糖酐酶活性影響見表1，對該酶具有激活作用金屬離子是Mn2+和Ca2+， Mn2+具有顯著的激活作用，Ca2+有微弱的激活作用；Ba2+和Mg2+基本不影響該右旋糖酐酶的作用；具有抑制性的離子順序?yàn)镃u2+> Fe3> Zn2+，Cu2+抑制作用最強(qiáng)，對該右旋糖酐酶的抑制力接近40%。

表1 金屬離子對右旋糖酐酶活力的影響

3 討論

右旋糖酐酶是專一性地降解右旋糖酐中的1,6-糖苷鍵，可以將腸膜狀明串珠菌發(fā)酵產(chǎn)生的高分子右旋糖酐酶解為一定分子量分布的右旋糖酐，用于醫(yī)藥等行業(yè)。從溫度對右旋糖酐酶作用影響曲線(圖1)可以看出，反應(yīng)的最適溫度為55℃，在55℃測出的酶活力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他溫度，說明該右旋糖酐酶在55℃反應(yīng)速率最高；酶的熱穩(wěn)定性顯示，50℃以下比較穩(wěn)定，55℃就有明顯的活力損失。因此在該右旋糖酐酶用于水解右旋糖酐的溫度選擇是時(shí)，既要考慮酶的最適反應(yīng)溫度，也要考慮它的耐熱性。該右旋糖酐酶作用的最適pH為pH 5.0，酶的酸堿穩(wěn)定性研究表明：在pH2.2～9.6范圍內(nèi)相對穩(wěn)定，具有良好的酸堿穩(wěn)定性，在右旋糖酐酶的應(yīng)用中具有寬泛的pH范圍。該右旋糖酐酶作用的最適底物濃度為2%，但是這一數(shù)據(jù)是和酶濃度相關(guān)，在具體應(yīng)用中需要根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)一步確定。酶的底物特異性顯示酶的親和力隨底物分子量的增加而增強(qiáng)，尤其是對分子量1 000萬以上的右旋糖酐的親和力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于100萬以下的右旋糖酐，這一特點(diǎn)有益于酶法降解高分子右旋糖酐制備一定低分子量的右旋糖酐。金屬離子對酶作用應(yīng)先結(jié)果表明，Ba2+和Mg2+對該右旋糖酐酶的作用基本無影響；對該右旋糖酐酶具有抑制性的離子順序?yàn)镃u2+> Fe3> Zn2+，Cu2+抑制作用最強(qiáng)；Mn2+具有顯著的激活作用。作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究，但在該右旋糖酐酶的應(yīng)用中應(yīng)注意到金屬離子的影響。右旋糖酐酶的酶學(xué)性質(zhì)研究，為右旋糖酐酶代替鹽酸水解右旋糖酐生產(chǎn)醫(yī)用右旋糖酐奠定基礎(chǔ)，有助于醫(yī)用右旋糖酐的生產(chǎn)工藝改進(jìn)，提高產(chǎn)品品質(zhì)和生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)企業(yè)環(huán)保符合，使醫(yī)用右旋糖酐的生產(chǎn)綠色高效。