張曉虎，楊風(fēng)婷，殷佳琦，肖秦箭

(商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西 商洛 726000)

0 引言

在食品保鮮劑研究領(lǐng)域已廣泛利用中草藥等植物源中有效保鮮成分研發(fā)天然食品保鮮劑。藥用植物黃芩的提取物能夠有效抑制多種細(xì)菌生長(zhǎng)，如金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、蠟樣芽胞桿菌、沙門氏菌等，從黃芩中提取防腐保鮮物質(zhì)并用于食品保藏已引起人們關(guān)注[1]。

黃芩中的成分極為復(fù)雜，主要包括漢黃芩苷等在內(nèi)的黃酮類物質(zhì)是其發(fā)揮功效的主要活性成分[2～4]。程存歸等[5]采用微波輔助水提或有機(jī)溶劑提取的方法研究得出黃芩中黃芩苷的最佳提取工藝；李芳等[6]采用微波輔助乙醇回流聯(lián)合方法從黃芩中提取黃芩苷；梁英等[7]采用二次正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)研究乙醇回流浸提黃芩黃酮的優(yōu)化工藝；王雪等[8]采用中心組合設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法研究黃芩中抗菌有效活性成分優(yōu)化提取工藝；魏長(zhǎng)志[9]研究比較表明黃芩對(duì)金黃色葡萄球菌和痢疾桿菌的抗菌活性的影響次于黃連而優(yōu)于黃柏；霍峰巖等[10]研究了不同濃度黃芩提取物對(duì)芒果貯藏保鮮效果的影響。但查閱文獻(xiàn)未見有關(guān)針對(duì)黃芩根部漢黃芩苷提取物用于食品防腐保鮮的相關(guān)研究報(bào)道。

研究選取出自秦嶺腹地商洛山區(qū)的量大、質(zhì)優(yōu)、國(guó)內(nèi)知名的“五大商藥”之一的黃芩[11]，采用微波輔助乙醇浸提法從干燥的黃芩根部提取漢黃芩苷，用分光光度法測(cè)定漢黃芩苷的含量；根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，確定最佳提取工藝；做漢黃芩苷抑菌實(shí)驗(yàn)，確定最佳抑菌濃度；制備復(fù)合保鮮液并用于圣女果的保鮮貯藏。研究結(jié)果將為黃芩中漢黃芩苷作為保鮮成分在果蔬保藏中的應(yīng)用提供技術(shù)參考，促進(jìn)商洛當(dāng)?shù)攸S芩資源的綜合開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑 材料：兩年生黃芩根(2017年9月13日采挖于陜西省商洛市商州區(qū)商洛學(xué)院中草藥種植園)；新鮮圣女果(2018年5月12日采摘于商州區(qū)劉灣街道辦事處設(shè)施蔬菜棚區(qū))。

試劑：漢黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品，無水乙醇，牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，抗壞血酸(Vc)，海藻酸鈉，氯化鈣，酚酞，NaOH溶液，蒸餾水等。

菌種：金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、枯草芽孢桿菌。

1.1.2 儀器 MDS-6G型多通量微波萃取系統(tǒng)，北京安和美誠(chéng)科學(xué)儀器有限公司；755B型紫外可見分光光度計(jì)，上海光學(xué)儀器儀器有限公司；SI-234型電子分析天平，奧然科技有限公司；202型電熱恒溫干燥箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；HJH-DNP-9082型恒溫培養(yǎng)箱，廣州航信科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)材料預(yù)處理 將完整挖出黃芩的根部洗凈、去其皮及須根，置于烘箱中60℃烘干，高速萬能粉碎機(jī)粉碎，過40目篩，置于干燥的廣口瓶?jī)?nèi)，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 漢黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 稱取漢黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，放入50 mL容量瓶中，用50%乙醇定容。用移液管分別移取1、2、3、4、5 mL漢黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液于5個(gè)10 mL的容量瓶中，用50%乙醇定容，搖勻，放置10 min，以空白乙醇溶液為對(duì)照，用紫外分光光度計(jì)在330 nm處測(cè)定其吸光度。每個(gè)樣品測(cè)定3組平行，取平均值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，得到回歸方程y = 13.757x + 0.0076，R2=0.9947，可以此求出漢黃芩苷的含量。

圖1 漢黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.3 黃芩根漢黃芩苷的提取 精確稱取黃芩根粉末1 g，按一定料液比加定量乙醇，置于微波萃取系統(tǒng)，選擇一定的微波功率進(jìn)行提取，接受一定的微波輻射時(shí)間，待溶劑揮發(fā)冷凝回流后，取出冷卻至室溫，重新置于多通量微波萃取系統(tǒng)中，上述步驟重復(fù)操作以累計(jì)達(dá)到設(shè)計(jì)的總輻射時(shí)間值為至。提取完成后過濾，將上清液轉(zhuǎn)入離心管中，5 400 r·min-1離心15 min獲取上清液，即得黃芩根提取液。

1.2.4 黃芩根漢黃芩苷提取率的測(cè)定 吸取黃芩根提取液1 mL，以漢黃芩苷為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定波長(zhǎng)330 nm處的吸光度，結(jié)合1.2.2線性回歸方程計(jì)算提取液中漢黃芩苷提取率，計(jì)算公式如下：

W%=[(C×n×V)+M]×100%

式中：C—提取液濃度，mg·mL-1；n—稀釋倍數(shù)；V—提取液體積，mL；M—所用黃芩根的質(zhì)量，mg。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn) 以黃芩根部漢黃芩苷提取率為指標(biāo)，研究乙醇體積分?jǐn)?shù)(40、50、60、70、80%)、料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25)、微波功率(300、400、500、600、700 W)、微波加熱時(shí)間(2、4、6、8、10 min)4個(gè)因素對(duì)黃芩根中漢黃芩苷提取率的影響[12]。

1.2.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 依據(jù)以上4個(gè)考察因素，以漢黃芩苷的提取率為指標(biāo)，設(shè)計(jì)4因素3水平的正交試驗(yàn)[13]。

1.2.7 抑菌效果試驗(yàn) 研究漢黃芩苷提取液對(duì)大腸埃希氏菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌效果，確定最低抑菌濃度[14,15]。

1.2.8 復(fù)合保鮮液的配制 選用抗壞血酸、海藻酸鈉、氯化鈣、漢黃芩苷提取液作為保鮮液配方的組分，采用不同濃度進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，見表1。

1.2.9 保鮮效果試驗(yàn) 取當(dāng)日采摘的新鮮圣女果用蒸餾水沖洗干凈，晾干后將配方不同保鮮液噴灑至圣女果上，放置在20℃、相對(duì)濕度為70%的培養(yǎng)箱中進(jìn)行貯藏保鮮，對(duì)照空白組用蒸餾水處理，間隔1d取樣測(cè)定防腐保鮮效果指標(biāo)[16,17]。圣女果的感官品質(zhì)、腐爛率、失重率均用全部果實(shí)測(cè)定；可滴定有機(jī)酸含量測(cè)定的圣女果，隨機(jī)取樣、破碎、勻漿。試驗(yàn)均重復(fù)3次，取其平均值。

感官品質(zhì)：觀察圣女果外觀、色澤，測(cè)定硬度，評(píng)價(jià)風(fēng)味與口感，判斷其優(yōu)劣狀況。

腐爛率% =(腐爛果實(shí)質(zhì)量/總果實(shí)質(zhì)量)×100 %

失重率% = [(原重-實(shí)重)/原重]×100 %

可滴定酸含量：每組稱取圣女果100 g，去掉果皮后勻漿，量取5 mL漿液，蒸餾水定容至50 mL后過濾并收集濾液，酚酞作指示劑，用標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定，以檸檬酸為折算系數(shù)，以堿液的耗量計(jì)算可滴定酸的含量。同時(shí)以蒸餾水做空白對(duì)照，此時(shí)測(cè)定的即為圣女果果肉中有機(jī)酸的含量。

表1 漢黃芩苷復(fù)合保鮮液配方

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃芩根漢黃芩苷提取率的影響 如圖2所示，漢黃芩苷提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而逐漸增加；達(dá)到50%后，漢黃芩苷提取率又迅速下降，結(jié)果顯示并非乙醇體積分?jǐn)?shù)越高提取率越高，其作用濃度范圍是一定的。究其原因：一是微波加熱是直接作用于介質(zhì)分子，乙醇和水都是極性分子，但兩者在結(jié)構(gòu)上有較大差異，須有一定比例關(guān)系才能使效果達(dá)到最佳。二是雖然乙醇溶液對(duì)漢黃芩苷具備良好的溶解性，但在一定濃度范圍內(nèi)，漢黃芩苷的溶解效果較好。因此，選取50%作為較佳的乙醇體積分?jǐn)?shù)。

2.1.2 料液比對(duì)黃芩根漢黃芩苷提取率的影響 如圖3所示，漢黃芩苷的提取率隨著料液比的增加而增加，但在料液比為1∶15之后又開始下降，即當(dāng)料液比為1∶15時(shí)提取率最高。因此，選擇1∶15作為較佳的料液比。

2.1.3 微波功率對(duì)黃芩根漢黃芩苷提取率的影響 如圖4所示，在500W微波功率范圍內(nèi)，隨著微波功率的升高，提取率逐漸增大。功率500W時(shí)，提取率達(dá)到最大。由此可知，隨著微波功率的增加，黃芩細(xì)胞破壞更充分，更多的漢黃芩苷從原料中溶出。因此，選取500W作為最佳的微波功率。

2.1.4 微波加熱時(shí)間對(duì)黃芩根漢黃芩苷提取率的影響 如圖5所示，漢黃芩苷提取率隨加熱時(shí)間推移有所增加，當(dāng)加熱時(shí)間為6 min時(shí)，提取率最大。當(dāng)加熱時(shí)間繼續(xù)上升時(shí)，提取率開始下降，這是因?yàn)槲⒉梢运查g產(chǎn)生大量熱量，溫度過高、加熱時(shí)間過長(zhǎng)可能會(huì)對(duì)漢黃芩苷有破壞作用。因此，選取6 min作為最佳加熱時(shí)間。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

選取乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、料液比(B)、微波加熱時(shí)間(C)、微波功率(D)為影響黃芩根漢黃芩苷提取率的因素，黃芩苷的提取率為指標(biāo)，設(shè)計(jì)4因素3水平的正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃芩根漢黃芩苷提取率的影響

圖3 料液比對(duì)黃芩根漢黃芩苷提取率的影響

圖4 微波功率對(duì)黃芩根漢黃芩苷提取率的影響

圖5 微波加熱時(shí)間對(duì)黃芩根漢黃芩苷提取率的影響

實(shí)驗(yàn)號(hào)因素 A乙醇體積分?jǐn)?shù)/%B料液比/(g·mL-1)C微波加熱時(shí)間/min D 微波功率/W漢黃芩苷提取率/%11(40)1(1∶10)1(4)1(400) 0.020212(1∶15)2(6)2(500)0.026313(1∶20)3(8)3(600)0.03642(50)123 0.03952231 0.04562312 0.01573(60)132 0.02583213 0.02993321 0.040K10.0820.0840.0640.105K20.0990.1000.1050.066K30.0940.0910.1060.104k10.0270.0280.0210.035k20.0330.0330.0350.022K3 0.031 0.0300.0350.035R 0.017 0.016 0.042 0.039

由表2結(jié)果可知，根據(jù)極差分析判定對(duì)黃芩根漢黃芩苷提取率的影響因素大小依次為：微波加熱時(shí)間>微波功率>乙醇體積分?jǐn)?shù)>料液比。由正交試驗(yàn)結(jié)果可得出最佳水平組合為A2B2C3D1。因此，經(jīng)正交設(shè)計(jì)優(yōu)化后的提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、料液比1∶15、微波加熱時(shí)間8 min、微波功率400 W。

2.3 抑菌試驗(yàn)結(jié)果與分析

表3 漢黃芩苷對(duì)三種供試菌種的抑菌效果

注：表中“-”表示無菌長(zhǎng)出；“+”表示有少量菌落長(zhǎng)出；“++”表示有大量菌落長(zhǎng)出；“+++”表示培養(yǎng)皿幾乎長(zhǎng)滿菌落。

由表3抑菌效果分析可得：金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為0.20 mg·mL-1；枯草芽孢桿菌和大腸埃希氏菌最低抑菌濃度為0.50 mg·mL-1。

2.4 保鮮效果試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.4.1 感官指標(biāo)趨勢(shì)分析 如圖6所示，隨著保藏時(shí)間延長(zhǎng)，不同濃度復(fù)配保鮮液處理的圣女果的綜合感官評(píng)分均為下降趨勢(shì)。由實(shí)驗(yàn)可以看出，圣女果經(jīng)復(fù)合保鮮液處理后，綜合感官評(píng)分雖下降但圣女果感官出現(xiàn)了不同程度變化，第8組處理對(duì)綜合感官評(píng)分變化最小，空白對(duì)照組綜合感官評(píng)分下降最明顯速度最快，說明復(fù)合保鮮液能明顯的改善圣女果的感官品質(zhì)。

2.4.2 腐爛率指標(biāo)趨勢(shì)分析 如圖7所示，隨著保藏時(shí)間的延長(zhǎng)，圣女果的爛果率呈上升趨勢(shì)，且于3 d后大幅上升； 7 d時(shí)處理1在抑制圣女果腐爛方面的效果最差，爛果率已經(jīng)高達(dá)39%，而處理8果實(shí)的爛果率顯著低于其他處理為22%，空白對(duì)照組效果最差。

2.4.3 失重率指標(biāo)趨勢(shì)分析 如圖8所示，隨保藏時(shí)間延長(zhǎng)，圣女果的失重率隨之增加，其中處理8上升的趨勢(shì)最緩慢，7 d時(shí)失重率為3.9%，而處理2已經(jīng)達(dá)到7.8%，空白對(duì)照組上升迅速，圣女果失水嚴(yán)重。從失重率指標(biāo)可知，最佳復(fù)配組合是處理8。

2.4.4 可滴定有機(jī)酸趨勢(shì)分析 圣女果中的有機(jī)酸在貯藏期間，部分通過呼吸作用被消耗，部分在果肉內(nèi)轉(zhuǎn)化為糖分。如圖9所示，在貯藏中的酸含量整體呈下降趨勢(shì)，第8組處理下降速度稍慢，可見復(fù)配保鮮液有效延緩了圣女果貯藏期間可滴定酸含量的下降趨勢(shì)，有利于提高圣女果貯藏保鮮效果。

圖6 綜合感官指標(biāo)隨保藏時(shí)間變化趨勢(shì)

圖7 腐爛率隨保藏時(shí)間變化趨勢(shì)

圖8 失重率隨保藏時(shí)間變化趨勢(shì)

圖9 可滴定有機(jī)酸隨保藏時(shí)間變化趨勢(shì)

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

以商洛黃芩為研究對(duì)象，采用微波輔助乙醇浸提正交試驗(yàn)的方法優(yōu)化黃芩根中漢黃芩苷的提取工藝；在漢黃芩苷抑菌實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，制備漢黃芩苷提取物與海藻酸鈉、氯化鈣和抗壞血酸復(fù)合保鮮液并用于圣女果保藏，得到以下結(jié)論：

(1)基于正交試驗(yàn)優(yōu)化取得的漢黃芩苷提取工藝參數(shù)為：乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、料液比1∶15、微波加熱時(shí)間8 min、微波功率400 W。影響提取率的因素大小依次為微波加熱時(shí)間>微波功率>乙醇體積分?jǐn)?shù)>料液比。

(2)抑菌實(shí)驗(yàn)表明：當(dāng)金黃色葡萄球菌中漢黃芩苷的添加濃度超過0.20 mg·mL-1，枯草芽孢桿菌和大腸埃希氏菌添加濃度超過0.50 mg·mL-1時(shí)，表現(xiàn)出抑菌效果。

(3)制備的復(fù)合保鮮液最優(yōu)配方為：海藻酸鈉濃度1.2%、氯化鈣2.0%、抗壞血酸1.5%、漢黃芩苷0.5%；使用該配方能有效改善圣女果貯藏期間的感官品質(zhì)，抑制失重率及腐爛率的上升，延緩可滴定酸含量下降趨勢(shì)，保鮮效果良好。

3.2 討論

(1)研究采用微波輔助乙醇浸提黃芩根漢黃芩苷，微波輔助法能夠破壞植物細(xì)胞壁，加速漢黃芩苷溶出，比傳統(tǒng)方法省時(shí)省力且安全無污染，利于提高提取率。

(2)研究取得的有關(guān)黃芩根中漢黃芩苷提取工藝參數(shù)，對(duì)漢黃芩苷的抑菌效果及最低抑菌濃度進(jìn)行初步研究，未對(duì)漢黃芩苷進(jìn)行分離純化處理。結(jié)果表明黃芩根漢黃芩苷對(duì)大腸埃希氏菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌均有一定抑制效果，試驗(yàn)結(jié)果與黃芩有效抑菌成分的研究結(jié)論基本一致[18]。

(3)建議在以后的研究中注意：適宜的微波加熱時(shí)間是影響漢黃芩苷提取率的重要因素，因?yàn)槲⒉梢运查g產(chǎn)生大量熱量，溫度升高，加熱時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)對(duì)漢黃芩苷有破壞作用，因此需控制微波加熱時(shí)間，否則會(huì)造成有效成分流失，降低漢黃芩苷提取率。