王敏奇 葉珊珊 杜勇杰 陶文靜 謝小利

(浙江大學動物科學學院，動物分子營養(yǎng)學教育部重點實驗室，杭州 310029)

載銅納米殼聚糖對斷奶仔豬生長性能、免疫和抗氧化指標的影響

王敏奇 葉珊珊 杜勇杰 陶文靜 謝小利

(浙江大學動物科學學院，動物分子營養(yǎng)學教育部重點實驗室，杭州 310029)

本試驗旨在研究不同劑量載銅納米殼聚糖(CNP-Cu)對斷奶仔豬生長性能、免疫和抗氧化指標的影響。選擇108頭平均體重(7.20±0.81)kg的21日齡“杜×長×大”三元雜交斷奶仔豬，隨機分成6組，每組3個重復，每個重復6頭豬。對照組飼喂基礎飼糧;抗生素組在基礎飼糧中添加100 mg/kg金霉素;試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組在基礎飼糧中分別添加50、100、150、200 mg/kg的CNP-Cu。試驗期28 d。飼養(yǎng)試驗結束后，前腔靜脈采血制血清，測定免疫及抗氧化指標。結果表明:1)飼糧中添加CNP-Cu能提高仔豬平均日采食量和平均日增重，降低料重比，降低腹瀉率，以100 mg/kg劑量組的作用效果最佳(P＜0.05);2)飼糧中添加CNP-Cu能顯著提高斷奶仔豬血清補體C3水平、谷胱甘肽過氧化物酶活性和總抗氧化能力(P＜0.05)。結果提示，飼糧中添加載銅納米殼聚糖能提高斷奶仔豬的免疫和抗氧化機能，提高生長性能，降低腹瀉率，具有替代抗生素的潛在應用價值。

載銅納米殼聚糖;斷奶仔豬;生長性能;免疫;抗氧化指標

仔豬早期隔離斷奶是規(guī)?；i場提高母豬利用率的重要手段之一，但由此產(chǎn)生的“仔豬早期斷奶應激”會導致斷奶仔豬采食量下降，生長遲滯，腹瀉率上升，生產(chǎn)性能大幅下降。為克服仔豬斷奶應激，生產(chǎn)中往往在斷奶仔豬飼料中添加大量抗生素。抗生素產(chǎn)生耐藥性的負面作用早已引起社會廣泛關注。在歐盟全面禁止在飼料中添加抗生素之后，我國對飼料中抗生素的使用也做出了嚴格的規(guī)定。研究開發(fā)新型安全的抗生素替代品也一直成為動物營養(yǎng)學界的研究熱點之一。殼聚糖(chitosan，CS)是迄今為止惟一發(fā)現(xiàn)的陽離子動物纖維和堿性多糖，具有抗菌和提高機體免疫力的重要功能，被認為是一種新型畜禽促生長劑、免疫增強劑、消化道黏膜保護劑和廣譜抗菌劑［1］。本課題組前期研究表明，殼聚糖納米粒徑化后表現(xiàn)出更高的抗菌性能［2］。在此基礎上，本課題組在納米殼聚糖上負載具殺菌功能的銅離子，研制成功了載銅納米殼聚糖復合微粒(copper loaded chitosan nanoparticles，CNP-Cu)。體外研究發(fā)現(xiàn)，納米殼聚糖在載銅后，殺菌能力大幅度增強，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小殺菌濃度下降了10倍［2］。在大鼠上的研究表明，CNP-Cu可增強大鼠的免疫機能，顯著提高血清免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白 G(IgG)、補體 C3和溶菌酶(LE)水平，改善大鼠生長性能［3］。但有關載銅納米殼聚糖在斷奶仔豬上的應用研究尚未見報道。因此，本研究以自行研制的CNP-Cu為試驗材料，探討其對斷奶仔豬的生長、免疫及抗氧化機能的影響，旨在為飼用抗生素替代品的研究與開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試驗設計

CNP-Cu微粒由本課題組自制，實測平均粒徑為772.4 nm，平均電荷為 63.62 mV，銅含量為1.504%;抗生素為15%的飼用金霉素(CTC)，購自武漢鑫華遠科技發(fā)展有限公司。

選擇108頭體況良好，平均體重為(7.20±0.81)kg的21日齡“杜×長×大”三元雜交斷奶仔豬，隨機分為6組，每組3個重復，每個重復6頭豬，公母各占1/2。對照組飼喂基礎飼糧;抗生素組在基礎飼糧中添加100 mg/kg的飼用金霉素;試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組在基礎飼糧中分別添加50、100、150、200 mg/kg 的 CNP-Cu。基礎飼糧參照NRC(1998)斷奶仔豬營養(yǎng)需要配制成粉狀全價料，基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Com position and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.2 飼養(yǎng)管理及待測指標

試驗仔豬采用分欄群飼，自由采食和飲水，進行常規(guī)仔豬免疫程序，飼養(yǎng)管理按常規(guī)進行。試驗前對豬舍常規(guī)進行消毒。預試期5 d，正試期28 d。試驗期間每天記錄飼料消耗量及腹瀉狀況。試驗結束后，禁飼24 h后稱重。計算平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)及腹瀉率(diarrhoea rate)。

1.3 樣品采集與保存

試驗結束當天08:00，所有參試豬前腔靜脈采血約 10 m L，3 000 r/m in離心 15 m in取血清，－70℃保存。采血前1天20:00停喂飼糧，使仔豬空腹12 h。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 血清免疫指標測定

血清 IgG、IgA、免疫球蛋白 M(IgM)，補體C3、C4的測定采用免疫濁度法，試劑盒購自上海復星長征醫(yī)學科學有限公司，在RX daytonaTM全自動生化分析儀上測定;LE的測定采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒。

1.4.2 血清抗氧化指標測定

血清谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)活性和總抗氧化能力(T-AOC)的測定采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示，采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，采用Duncan氏多重比較進行組間差異顯著性檢驗，P＜0.05為差異顯著。

2 結果

2.1 生長性能與腹瀉率

由表2可見，斷奶仔豬飼糧中添加不同劑量CNP-Cu均不同程度地改善了豬的生產(chǎn)性能，其中以100 mg/kg劑量組效果最佳，ADG、ADFI分別較對照組提高了 82.24%和29.76%(P＜0.05)，F(xiàn)/G 下降了28.82%(P＜0.05)，該組仔豬生產(chǎn)性能整體水平優(yōu)于金霉素組，但未達顯著水平(P＞0.05)。50 mg/kg劑量組豬的生產(chǎn)性能也有較好表現(xiàn)，ADG、ADFI分別較對照組提高了72.97%和27.04%(P＜0.05)，F(xiàn)/G 下降了 26.39%(P＜0.05)，與 金 霉 素 組 相 當。150 mg/kg 和200 mg/kg劑量組仔豬生產(chǎn)性能較對照組亦有改善，但低于50 mg/kg和100 mg/kg劑量組及金霉素組。結果可見，CNP-Cu對斷奶仔豬生長性能的改善無劑量線性相關，本梯度試驗表明，100 mg/kg為最佳劑量組。

斷奶仔豬飼糧中添加不同劑量CNP-Cu具有不同程度的抗腹瀉效果，以100 mg/kg劑量組最佳，仔豬腹瀉率較對照組下降了29.84%(P＜0.05)，與金霉素組相當。

表2 CNP-Cu對斷奶仔豬生長性能和腹瀉率的影響Table 2 Effect of CNP-Cu on growth performance and diarrhea rate of weaned piglets

2.2 血清免疫指標

由表3可見，飼糧中添加不同劑量CNP-Cu對斷奶仔豬血清免疫球蛋白有不同程度的提高，但未達到顯著水平(P＞0.05)。此外，50、100和150 mg/kg劑量組血清補體C3水平分別較對照組提高了 42.86%、57.14% 和42.86%(P＜ 0.05)。血清LE含量以100 mg/kg劑量組最高，較對照組提高了 28.70%(P＜0.05)。

表3 CNP-Cu對斷奶仔豬血清免疫指標的影響Table 3 Effect of CNP-Cu on serum immune indices of weaned piglets

2.3 血清抗氧化指標

由表4可見，飼糧中添加CNP-Cu均不同程度地提高了血清中 GSH-Px的活性，50、100、150和200 mg/kg劑量組分別較對照組提高了10.26%(P＜ 0.05)、7.12%(P＜ 0.05)、5.51%(P＞0.05)和8.55%(P＜0.05)。與對照組相比，50、100、150和200 mg/kg劑量組血清T-AOC分別提高了27.07%、33.70%、28.18% 和 24.31%(P＜0.05)。各組間SOD、CAT和POD活性未發(fā)現(xiàn)有顯著差異(P＞0.05)。

表4 CNP－Cu對斷奶仔豬血清抗氧化指標的影響Table 4 Effect of CNP-Cu on serum antioxidant indices of weaned piglets

3 討論

3.1 CNP-Cu對斷奶仔豬生長性能和腹瀉率的影響

Braude［4］首次發(fā)現(xiàn)飼糧中添加動物正常需要量10倍的銅，可明顯提高動物的生長性能。銅離子已被證實具有體內(nèi)抗菌的作用，銅離子復合體具有母體配體與無機銅離子所沒有的顯著藥理學效應。研究發(fā)現(xiàn)，有機銅源(蛋氨酸銅、賴氨酸銅、酪蛋白銅等)的作用效果明顯優(yōu)于無機銅源(硫酸銅、氧化銅等)［5－8］。殼聚糖是迄今為止惟一發(fā)現(xiàn)的堿性多糖，在其復雜的空間結構中含有高活性的功能基團，表現(xiàn)出類抗生素的特性，能夠抑制多種細菌的生長。殼聚糖納米化后由于納米粒子的特性而表現(xiàn)出更高的殺菌活性［9］。CNP-Cu是以殼聚糖和CuSO4為主要原料，運用納米技術構建的可降解、無毒無害的聚合物，具有粒徑小、表面電荷高等納米粒子特殊的生物學特性，能夠提高其在生物陽離子環(huán)境中的穩(wěn)定性，并通過與負電性生物膜的互作和體內(nèi)特異位點靶向作用提高其殺菌活性［2］。本試驗結果顯示，添加不同劑量CNP-Cu能提高斷奶仔豬的 ADG、ADFI和 F/G，其中100 mg/kg劑量組的作用效果最顯著。與抗生素金霉素組相比，添加100 mg/kg的CNP-Cu組在提高生長性能方面的效果也具一定優(yōu)勢，但差異未達到顯著水平。這與課題組前期在大鼠上的研究相一致，與對照組相比，每天分別口服80和160 mg/kg BW的CNP-Cu能顯著提高大鼠的ADG和 F/G［3］。劑量梯度飼養(yǎng)試驗還發(fā)現(xiàn)，CNP-Cu對斷奶仔豬生長性能的改善不存在劑量線性相關性，高劑量添加未出現(xiàn)生產(chǎn)性能的進一步的改善。這與常規(guī)殼聚糖在動物上應用的效果基本一致。目前，較多報道表明殼聚糖具有提高動物生長性能的作用［10－13］，但推薦的適宜添加量不同，總體表現(xiàn)為低劑量促生長而高劑量抑制生長。有關CNP-Cu的最適添加量及高劑量抑制生長的機理還有待進一步深入研究。

仔豬早期斷奶易發(fā)生腹瀉，飼糧中抗生素的使用能明顯降低斷奶仔豬的腹瀉率［14－15］。本試驗結果表明，飼糧中添加100 mg/kg的金霉素能顯著降低斷奶仔豬的腹瀉率。添加不同劑量的CNP-Cu也能顯著降低仔豬腹瀉率，效果略低于抗生素組，但差異不顯著。CNP-Cu具有很高的電動電位，更容易與帶負電的菌體表面發(fā)生作用，因此表現(xiàn)出較高的殺菌活性，并通過破壞菌體細胞膜導致菌體內(nèi)物質(zhì)外泄而死亡［16］。前期對大鼠的研究表明，CNP-Cu有效抑制了腸道病原菌的生長和繁殖，降低了細菌酶活性，從而改善了腸黏膜形態(tài)結構和功能，有助于養(yǎng)分的充分消化和吸收利用［16］。這一點很好地解釋了本試驗中CNP-Cu能顯著降低斷奶仔豬的腹瀉率的作用機理，揭示CNP-Cu具備替代抗生素的巨大潛力。

3.2 CNP-Cu對斷奶仔豬血清免疫指標的影響

哺乳動物體內(nèi)起免疫保護作用的主要是IgG、IgA和IgM 3種免疫球蛋白。補體具有協(xié)助、補充和加強抗體及吞噬細胞免疫活性的作用，在機體防御體系中起到協(xié)同抗感染的作用。LE能溶解細菌細胞壁，也能使病毒失活，還參與機體多種免疫反應，是反映巨噬細胞功能的標志酶，是細胞免疫能力高低的一項重要指標。本課題組前期對大鼠的研究發(fā)現(xiàn)，CNP-Cu能顯著提高大鼠血清中IgA、IgG和LE的水平，補體C3的濃度也高于對照組，其作用效果優(yōu)于殼聚糖［16］。本試驗中未發(fā)現(xiàn)添加CNP-Cu對血清中3種免疫球蛋白含量產(chǎn)生顯著影響，但血清補體C3和LE含量均顯著高于對照組，尤以100 mg/kg劑量組效果最佳。研究認為，納米微粒容易被人或動物的免疫系統(tǒng)識別并通過胃腸道淋巴結吸收，同時，納米微粒還可延長免疫反應的時間，并誘發(fā)機體產(chǎn)生體液和細胞免疫反應［17］。

3.3 CNP-Cu對斷奶仔豬血清抗氧化指標的影響

動物在應激狀態(tài)下，機體抗氧化酶活性降低，消除氧化代謝產(chǎn)物的能力下降，從而導致體內(nèi)自由基產(chǎn)生與清除的動態(tài)平衡被打破，自由基逐漸積累并產(chǎn)生氧化損傷。SOD、GSH-Px、CAT、POD等具有很強的清除活性氧和自由基的作用，可提高機體的抗氧化能力，是常用的抗氧化指標［18］。本試驗發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加不同劑量CNP-Cu均顯著提高了血清GSH-Px活性和T-AOC。說明飼糧中添加CNP-Cu可改善斷奶仔豬抗氧化能力，緩解應激造成的自由基對機體生物膜的破壞，從而提高機體免疫力和抗病能力。

4 結論

① CNP-Cu能顯著提高斷奶仔豬的生產(chǎn)性能，降低腹瀉率，以100 mg/kg劑量組效果最佳。

② CNP-Cu可顯著提高血清補體C3水平、GSH-Px活性及T-AOC。

③斷奶仔豬飼糧中添加CNP-Cu能提高機體免疫力，增強抗氧化能力，從而產(chǎn)生抗斷奶應激，改善生產(chǎn)性能的效果。

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Author，WANG Minqi，associate professor，E-mail:wangmq@zju.edu.cn

(編輯 武海龍)

Chitosan Nanoparticles Loaded Copper Ions A ffect G row th Performance，Imm unity and Antioxidant Indices of Weaned Piglets

WANG Minqi YE Shanshan DU Yongjie TAO Wenjing XIE Xiaoli
(College of Animal Science，Zhejiang University;Key Laboratory of Molecular Animal Nutrition of Ministry of Education，Hangzhou310029，China)

The study was conducted to investigate the effect of dietary chitosan nanopartides loaded copper(CNP-Cu)on growth performance，immunity and antioxidant indices of weaned piglets.A total of 108 21-day-old threeway cross(Duroc×Landrace×Yorkshine)weaned pigletswith an initial average body weight of(7.20 ±0.81)kg were random ly assigned into 6 groupswith 3 replicates per group and 6 piglets per replicate.The piglets in control group were fed basal diet;Piglets in chlortetracycline(CTC)group were fed the basal diet supplemented with 100 mg/kg CTC，and piglets in four trial groups(Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ andⅣ)were fed the basal diet supplemented with 50，100，150 and 200 mg/kg CNP-Cu，respectively.The experiment lasted for 28 days.A fter term ination of the feeding trial，blood sampleswere collected from anterior vena cava of all piglets for serum indices analysis.The results showed as follows:1)supplementation of CNP-Cu increased average daily feed intake and average daily gain，and decreased feed gain ratio and diarrhea rate，and the optimal supplemental level of CNP-Cu was 100 mg/kg(P＜0.05).2)Serum complement component3，glutathione peroxidase activity and total antioxidant capacity were significantly increased with the supplementation of CNP-Cu(P＜0.05).These results suggest that supplemental CNP-Cu has beneficial effects on immune and antioxidant function in weaned pigs，which also can increase growth performance and decrease diarrhea rate.Accordingly，CNP-Cu has a potential to substitute antibiotics.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2011，23(10):1806-1811］

CNP-Cu;weaned pigs;growth performance;immune;antioxidant

S828

A

1006-267X(2011)10-1806-06

10.3969/j.issn.1006-267x.2011.10.022

2011－04－13

浙江省重大科技專項(2008C12048)

王敏奇(1972—)，男，浙江安吉人，博士，副研究員，主要從事動物營養(yǎng)與飼料科學研究。E-mail:wangmq@zju.edu.cn