趙楚生，陳瑞烈，林少銳，蔡綺純，吳健慧，謝 嬋

乙型肝炎是國人常見疾病，臨床表現(xiàn)多樣，可表現(xiàn)為急性、慢性遷延性、慢性活動性或暴發(fā)性等多種形式，其預后也不一樣。造成臨床表現(xiàn)多樣性的具體機制還不清楚，但可以肯定與機體免疫反應有關。乙型肝炎病毒侵入機體后產生由T細胞毒反應所介導的免疫反應，T細胞可分為CD4+和兩種亞群。細胞可進一步分為Th1、Th2和Th0亞型，Th0則是 Th1/Th2 的前體細胞［1］。細胞也可進一步分為Th1、Th2亞型，有學者將其分別命名為Tc1和Tc2［2］。Th1與細胞介導的免疫反應有關，Th2與體液免疫有關。Th1/Th2(Tc1/Tc2)細胞平衡是保持機體正常免疫機制所必需的，其失衡與乙型肝炎發(fā)展有明顯相關性，但也有不同意見者［3－6］。

目前采用流式細胞術分析外周血不同T淋巴細胞亞群。輔助性T細胞 (Th細胞)的表面標志為CD3+CD4+，當實驗用佛液脂 (PMA)刺激4 h，會發(fā)現(xiàn)CD4+細胞明顯減少，甚至消失。所以用CD3和CD8反設CD4細胞，即CD3+CD8－細胞被認為是CD3+CD4+細胞，用于分析Th1/Th2比例。而細胞毒性T細胞 (Tc細胞)的表面標志為CD3+CD8+，用于檢測Tc1/Tc2比例。目前，檢測外周血Th1/Th2、Tc1/Tc2細胞的方法主要與細胞因子有關，因γ－干擾素 (IFN－γ)為Th1和Tc1最特異分泌的細胞因子，白介素4(IL－4)為Th2和Tc2最特異分泌的細胞因子。通過檢測細胞因子IFN－γ和IL－4的表達來確定Th1和Th2、Tc1和Tc2細胞的百分率。即:CD3+CD8－IFN－γ+為Th1細胞，CD3+CD8－IL－4+為Th2細胞，CD3+CD8+IFN－γ+為Tc1細胞，CD3+CD8+IL－4+為Tc2細胞。

本研究采用流式細胞術分析各型乙型肝炎患者外周血不同T淋巴細胞亞群CD3+CD8－以及 CD3+CD8+中細胞因子IFN－γ、IL－4的表達，對外周血Th1/Th2、Tc1/Tc2細胞失衡與乙型肝炎慢性化以及進展的關系進行分析，探討免疫平衡機制在乙型肝炎發(fā)生發(fā)展和轉歸中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2006年7月—2008年12月在中山大學附屬汕頭醫(yī)院、中山大學附屬第三醫(yī)院住院及門診治療的各型乙型肝炎患者81例，其中男61例，女20例。入選標準:(1)年齡18～65歲，性別不限。(2)診斷標準:符合2000年西安第十次全國病毒性肝炎和肝病學術會議修訂標準。排除標準:(1)合并其他嚴重疾病，如心腎衰竭、糖尿病、腫瘤等。(2)甲狀腺功能亢進癥等自身免疫性疾病，服用抗排斥等免疫抑制劑。(3)甲、丙、丁、戊型肝炎病毒，TTV病毒，巨細胞病毒，皰疹病毒等重疊感染。

1.2 主要儀器及試劑 BD FACScalibur流式細胞儀 (美國BD公司)、CO2培養(yǎng)箱 (美國Forma Scientific公司)。

主要單抗:CD3－PE －Cy5、FITC、IL－4－PE－Cy7、IFN－γ－PE Texas Red和CD69－PE單抗均購自BD公司，鼠FITC－IgG1和PE－IgG1單抗為Pharmingen公司產品。

其他試劑:PMA、Ionomycin、BFA等試劑購自SIGMA公司，RPMI1640購自GIBCO公司，固定穿透試劑盒CytofixPCytopem kit購自Pharmingen公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) 空腹抽取患者外周靜脈血2～3 ml，肝素抗凝，按1∶1與無血清的RPMI－1640培養(yǎng)基混勻，加入刺激劑佛波酯 (PMA)和鈣離子霉素 (Ionomycin)，使其終濃度分別為25 ng/ml和1μg/ml，同時加入終濃度為10μg/ml的蛋白轉運抑制劑 (BFA);未刺激對照則只加BFA，不加刺激劑，混勻后細胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。

1.3.2 細胞膜表面抗原和細胞內細胞因子染色 加入20μlPE－Cy5和FITC單抗于檢測管中，再加100μl培養(yǎng)的全血，混勻，室溫暗處孵育15 min，加入溶血素2 ml，放置5～10min，待紅細胞裂解，1 000 r/min離心5min，棄上清液，將細胞用含0.5%小牛血清的PBS 2 ml洗滌1次，加入固定液CytofixPCytopem 0.5ml，固定20min，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，再加2 ml 1×CytopermPWash穿透劑室溫暗處穿透10 min，1 000 r/min離心5 min，然后加入20μl IL－4－PE－Cy7和IFN－γ－PE Texas Red單抗，混勻，室溫暗處孵育30 min，2 ml1×CytopermPWash穿透劑洗1次，最后加入0.5 m l 1%PFA固定待測。

1.3.3 結果分析 用CD3和CD8設門，F(xiàn)L1和FL2熒光通道則以相應同種型的鼠IgG染色細胞作陰陽分界線，仔細設置各熒光通道之間的熒光補償，然后進行IFN－γ和IL－4的檢測，每管獲取細胞數30 000個，用Cellquest軟件進行數據分析。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件，計量資料以 (x－±s)表示，兩組間比較用t檢驗，多個樣本均數比較采用方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 外周血T淋巴細胞亞群中細胞因子IFN－γ、IL－4的表達率 急性肝炎 (acute hepatitis B，AHB)和慢性肝炎 (chronic hepatitis B，CHB)患者外周血T淋巴細胞亞群中細胞因子IFN－γ、IL－4的表達見圖1。CHB組外周血 CD3+CD8

－、CD3

+CD8

+T細胞亞群IL－4表達率與AHB組比較，差異均有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)，即CHB Th2、Tc2細胞均高于AHB。而兩組IFN－γ表達率比較，差異均無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05，見表1)。

表1 急慢性乙型肝炎患者外周血T淋巴細胞亞群中細胞因子IFN－γ、IL －4的表達率 (x－ ±s，%)Table 1 Comparison of the cytokine expression rate of T lymphocyte subsets between the patientswith AHB and CHB

圖1 急性 (A)與慢性 (B)肝炎患者外周血T淋巴細胞亞群流式細胞儀檢測圖Figure 1 T lymphocyte subsets of AHB and CHB assessed by flow cytometry

2.2 不同程度CHB患者外周血T淋巴細胞亞群中細胞因子IFN－γ、IL－4的表達率 CHB輕度、中度、重度患者外周血T淋巴細胞亞群中細胞因子IFN－γ、IL－4的表達率見圖2。相對于輕度組，中度組和重度組CD3+CD8－、CD3+CD8+T細胞亞群IFN－γ表達均有增高 (P＜0.01)，即中度、重度組Th1、Tc1均高于輕度組。相對于中度組，重度組CD3+CD8－、CD3+CD8+T細胞亞群IFN－γ亦有增高 (P＜0.05，見表2)，即重度組Th1、Tc1均高于中度組。

表2 不同程度CHB患者外周血T淋巴細胞亞群中細胞因子IFN－γ、IL－4的表達率 (x－ ±s，%)Table 2 Comparison of the cytokine expression rate of T lymphocyte subsets between the patients with varying degrees of chronic hepatitis B

圖2 慢性輕度 (A)、中度 (B)、重度 (C)乙型肝炎患者外周血T淋巴細胞亞群流式細胞儀檢測圖Figure 2 T lymphocyte subsets of slight，moderate，severe chronic hepatitis B assessed by flow cytometry

3 討論

乙型肝炎病毒 (HBV)嚴重威脅人類健康。據世界衛(wèi)生組織 (WHO)報道，全世界有約20億人曾感染HBV，其中3.5億人為慢性HBV感染，每年大約有100萬人死于HBV感染引起的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細胞癌［7］。我國屬HBV感染地方性流行區(qū)。2006年我國流行病學調查結果顯示，一般人群HBV表面抗原 (HBsAg)攜帶率為7.18%。據此推算，我國現(xiàn)有的慢性HBV感染者約9 300萬人，其中，CHB患者約2 000 萬例［8］。

目前，乙型肝炎的治療仍是世界公認的難題。這主要是由于其發(fā)病機制尚未完全清楚，從而導致了治療和對預后評估的困難。

在大多數病毒感染性疾病中，機體特異性細胞免疫對于清除病毒感染起重要作用;另一方面，在某些條件下，免疫效應細胞和某些細胞因子在清除病毒的過程中可引起組織細胞損傷，產生不同程度的病理變化。乙型肝炎的發(fā)病主要是機體清除HBV而引發(fā)的細胞免疫病理改變［9］。HBV感染肝臟后，機體通過NK細胞、巨噬細胞以及特異性的細胞毒性T細胞(CTL)等免疫細胞清除被病毒感染的肝細胞［10］，若大量肝細胞被感染或機體免疫功能亢進，大量肝細胞受免疫細胞攻擊而迅速壞死，則引起重癥肝炎［11－12］。

Th1/Th2(Tc1/Tc2)免疫應答是近年來免疫學研究的熱點之一，其在乙型肝炎發(fā)病機制中的作用日益受到重視。研究HBV感染時Th1/Th2(Tc1/Tc2)狀態(tài)對認識乙型肝炎發(fā)生、發(fā)展、預后和觀察治療效果均有積極的意義［13］。本研究結果顯示CHB患者外周血Th2、Tc2細胞高于AHB，而隨著CHB活動程度的加劇Th1、Tc1細胞逐漸增多。本研究結果表明Th2、Tc2與乙型肝炎慢性化有關，各類CHB患者以Th2型反應為主，Th2型優(yōu)勢反應是HBV感染慢性化的主要原因之一。Th1/Th2調節(jié)機體細胞免疫和體液免疫的平衡，決定免疫應答的方向。Th1細胞分泌IL－2、IFN－γ、TNF等I型細胞因子，促進細胞免疫 (I型免疫反應)、細胞毒性T細胞的生長和活化、巨噬細胞的活化，介導遲發(fā)型變態(tài)反應。Th2細胞以分泌IL－4、IL－5為特征，通常還產生 IL－6、IL－9、IL－10和IL－13等Ⅱ型細胞因子，促進B細胞的生長、活化和分化，增進以IgE和IgG1類抗體為主的體液免疫 (Ⅱ型免疫反應)［14］?，F(xiàn)有資料表明:各類 CHB患者以Th2型反應為主，在此基礎上，肝臟的炎癥活動隨著Th1型免疫反應的波動而波動，Th1型免疫反應與肝臟炎癥的活動密切相關［15－17］。其機制可能為:Th1型細胞活化后，分泌IL－2，IFN－γ等Th1型細胞因子增多，它們能增強NK細胞、巨噬細胞以及特異性的CTL等免疫細胞的活性，使免疫攻擊加強;增加肝細胞表面的HLA－I類分子表達，提高肝細胞對免疫細胞的細胞毒作用的敏感性;另外，還能夠加強趨化活性，吸引炎性細胞聚集，加重炎癥反應。這樣，Th1型反應在促進細胞免疫反應，清除病毒的同時，還會加劇肝細胞的炎癥損傷，致使病情發(fā)展加重。這也能解釋本研究中隨著CHB活動程度的加劇Th1、Tc1細胞逐漸增多。

本研究通過流式細胞術對外周血Th1/Th2、Tc1/Tc2細胞失衡與乙型肝炎病情轉歸的關系進行分析，探討免疫平衡機制在乙型肝炎發(fā)生、發(fā)展、轉歸和預后中的作用。由于流式細胞技術日益成熟，外周血Th1/Th2、Tc1/Tc2有望成為判斷乙型肝炎病情、預后及治療療效的重要指標，具有廣泛的臨床應用前景。由于免疫失衡有著復雜的機制，其進一步的分子生物學機制尚待闡明。

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