薛延豐,馮慧芳，石志琦,嚴(yán)少華

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品質(zhì)量安全檢測(cè)研究所,江蘇 南京 210094； 2.江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,江蘇 南京 210094；3.農(nóng)業(yè)部食品安全監(jiān)控重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210094； 4.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210097； 5.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所,江蘇 南京 210014)

水葫蘆，學(xué)名鳳眼蓮，原產(chǎn)于南美洲，屬雨久花科，具有發(fā)達(dá)的水下根系。水葫蘆龐大的根須能夠持續(xù)地吸收水中的污染物，其驚人的繁殖速度造就了超強(qiáng)的凈化水質(zhì)的本領(lǐng)。水葫蘆的資源化利用已經(jīng)成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)水葫蘆體內(nèi)富含氮、磷、鉀，其植株干物質(zhì)中含氮6.56%，磷0.84%，鉀12.32%，鈣4.58%，鎂1.58%，鐵0.671%，錳0.446%，碳氮比接近15，其發(fā)酵液幾乎含有植物生長(zhǎng)的所有營(yíng)養(yǎng)元素[8]。水葫蘆發(fā)酵液具有促進(jìn)作物生長(zhǎng)、抗病蟲害等功效，利用生物厭氧發(fā)酵形成的發(fā)酵液是一種優(yōu)質(zhì)的有機(jī)肥料和廣譜性的生物農(nóng)藥。同時(shí)，本研究測(cè)定發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液中重金屬的含量分別為汞0.011 mg/kg、鎘0.004 mg/kg、砷0.002 mg/kg、汞0.000 1 mg/kg，達(dá)到國(guó)家有關(guān)生物肥料的標(biāo)準(zhǔn)和要求[9]。但有關(guān)水葫蘆發(fā)酵后的沼液如何進(jìn)行合理利用，目前相關(guān)研究的報(bào)道較少。本研究選取青菜(Brassicarapa)為研究對(duì)象，分析被水葫蘆沼液浸種后青菜根系活力、蛋白質(zhì)含量、亞硝酸鹽含量、可溶性糖以及抗壞血酸含量的變化，以期進(jìn)一步為水葫蘆沼液浸種的可行性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1植物材料 供試蔬菜為青菜 (綠領(lǐng)矮抗1號(hào))；供試沼液取自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水葫蘆發(fā)酵后產(chǎn)生的沼液，其pH值為7.06，全氮0.75 g/kg，全磷0.22 g/kg，全鉀0.15 g/kg。

1.1.2材料處理 青菜種子采用0.3%的H2O2消毒12 h，用蒸餾水洗凈后將種子平鋪于干燥的培養(yǎng)皿中，曬種2 d，每天曬6 h，不定時(shí)翻動(dòng)3～4次。將曬好的種子進(jìn)行浸種處理，浸種6 h后將種子撈出，清水洗凈，晾干[10]，挑選均一、形態(tài)正常、曬好的種子置于鋪3層濾紙的培養(yǎng)皿 (直徑15 cm) 中，每皿100粒，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，發(fā)芽后光照時(shí)間12 h，溫度(19±1)℃。第1天向各培養(yǎng)皿中加入20 mL不同劑量處理液，使濾紙完全浸濕，每日補(bǔ)充等量蒸發(fā)掉的溶液以保持濾紙濕潤(rùn)。處理7 d 后收獲，用于生理生化指標(biāo)測(cè)定。具體浸種處理為對(duì)照(CK)，蒸餾水；Z1，蒸餾水∶沼液=1∶1；Z2，蒸餾水∶沼液=1∶1.5；Z3，蒸餾水∶沼液=1∶2；Z4，全沼液。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1鮮質(zhì)量和干質(zhì)量測(cè)定 試驗(yàn)結(jié)束后，每皿隨機(jī)挑取6棵生長(zhǎng)狀況較一致的幼苗，用去離子水洗凈吸干后測(cè)其鮮質(zhì)量，之后樣品經(jīng)110℃殺青30 min，75℃烘干至質(zhì)量不變，稱其干質(zhì)量[11-12]。

1.2.2根系活力測(cè)定 稱取植物新鮮根系0.15 g,將根浸沒于含0.2%氯化三苯基四氮唑(TTC)的66.7 mmol/L的磷酸緩沖液,避光37℃保溫1 h后加入1 mol/L的硫酸終止反應(yīng)。取出根研磨后用乙酸乙酯反復(fù)提取紅色的TTC還原產(chǎn)物三苯甲基(TTF)，485 nm波長(zhǎng)下測(cè)定提取液的OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算TTC還原量。以單位時(shí)間內(nèi)單位鮮根還原TTC的量[mg/(g·h)]表示根系還原力,以此反映植株的根系活力[13]。

1.2.3亞硝酸離子(NO2-)含量測(cè)定 參照李鴻恩等[14]方法測(cè)定，取青菜樣品2～3 g，研磨至勻漿狀，在弱堿性條件下，用熱水從樣品中提取NO2-，用亞鐵氰化鉀和乙酸鋅沉淀蛋白，過濾得透明無色溶液，再加入磺胺和萘乙二胺鹽酸鹽，在波長(zhǎng)538 nm處測(cè)量生成的紅色復(fù)合物的吸光度，計(jì)算樣品中原有的NO2-含量。

為什么，他粗礫帶著黑色污垢的手掌拍在我肩上會(huì)讓我想哭呢，為什么他迷黃渾濁皺紋橫生的雙眼會(huì)讓我覺得親切呢。

1.2.4蛋白質(zhì)含量測(cè)定 可溶性蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定，具體參考Bradford[15]的方法，以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.2.5可溶性糖含量測(cè)定 可溶性糖測(cè)定采用蒽酮比色法[16]。

1.2.6抗壞血酸含量測(cè)定 還原型抗壞血酸(AsA)、脫氫抗壞血酸(DHA)和總抗壞血酸(AsA+DHA)含量參照Turcsányi等[17]的方法測(cè)定。稱取1 g青菜葉片在4℃下于5%的偏磷酸中研磨成勻漿，然后于4℃下 22 000×g離心15 min，收集上清液用于測(cè)定AsA+DHA和AsA的含量。測(cè)定AsA+DHA時(shí)，取0.3 mL上清液，加入0.75 mL含5 mmol/L EDTA的磷酸緩沖液(150 mmol/L，pH值7.4)和0.15 mL 10 mmol/L的DTT。室溫下放置10 min后，加入0.15 mL 0.5% N-乙基馬來酰亞胺以消除多余的DTT。然后加入0.6 mL的10%三氯乙酸 (TCA)、0.6 mL的44%正磷酸溶液、0.6 mL的4%雙吡啶酒精(70%) 溶液和0.15 mL的0.3%(w/v)FeCl3溶液。混勻后40℃水浴40 min，測(cè)525 nm處的吸光值。AsA的測(cè)定過程中以0.3 mL水代替DTT和N-乙基馬來酰亞胺，其余操作步驟如上所述。DHA為總抗壞血酸與AsA的差值。

2 結(jié)果與分析

2.1沼液對(duì)青菜生長(zhǎng)的影響 在非全沼液處理下，植株的生物量隨著沼液施用量的增加而增加(表1)；當(dāng)為全沼液時(shí)，植株的生物量有所降低。就鮮質(zhì)量而言，Z1處理的鮮質(zhì)量是對(duì)照的1.06倍，與對(duì)照相比差異不顯著(P>0.05)；Z2和Z3處理下的鮮質(zhì)量分別是對(duì)照的1.20倍和1.31倍，與對(duì)照差異均顯著(P<0.05)；在全沼液Z4處理下，鮮質(zhì)量與Z3相比顯著降低，但顯著大于對(duì)照 (P<0.05)，是對(duì)照的1.16倍。干質(zhì)量的變化趨勢(shì)與鮮質(zhì)量相似。說明用適量的水葫蘆沼液對(duì)青菜種子進(jìn)行浸種處理，有助于植株的生長(zhǎng)。

表1 不同浸種處理對(duì)青菜生物量的影響

2.2沼液對(duì)青菜根系活力影響 隨著沼液處理劑量的增加青菜根系活力呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)(圖1)。在低劑量Z1處理下，根系活力是對(duì)照的1.13倍，顯著大于對(duì)照(P<0.05)；隨著沼液處理濃度的增加根系活力增加，Z2和Z3根系活力分別是對(duì)照的1.33倍和1.38倍，均顯著大于對(duì)照(P<0.05)，但Z2和Z3差異不顯著；在全沼液Z4處理下，根系活力是對(duì)照的1.28倍，顯著大于對(duì)照(P<0.05)。

圖1 不同浸種處理對(duì)青菜根系活力的影響

2.3沼液對(duì)青菜體內(nèi)NO2-含量的影響 亞硝酸鹽含量是評(píng)價(jià)蔬菜品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。不同處理對(duì)青菜體內(nèi)亞硝酸鹽含量影響不同(圖2)。在低劑量Z1處理下，亞硝酸鹽含量有所增加，是對(duì)照的1.03倍，但與對(duì)照差異不顯著(P>0.05)；隨著沼液處理劑量的增加，青菜體內(nèi)亞硝酸鹽含量與對(duì)照相比顯著降低，Z2和Z3體內(nèi)亞硝酸鹽含量分別是對(duì)照的91.2%(P<0.05)和87.6%(P<0.05)；在全沼液Z4處理下，亞硝酸鹽含量與對(duì)照相比差異不顯著。

圖2 不同浸種處理對(duì)青菜體內(nèi)NO2-含量的影響

2.4沼液對(duì)青菜體內(nèi)蛋白質(zhì)含量的影響 隨著沼液處理劑量的增加青菜體內(nèi)蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)(圖3)。在低劑量Z1處理下，蛋白質(zhì)含量是對(duì)照的1.32倍，顯著大于對(duì)照(P<0.05)；隨著沼液處理劑量的增加，青菜體內(nèi)蛋白質(zhì)含量與對(duì)照相比顯著增加，Z2和Z3蛋白質(zhì)含量分別是對(duì)照的1.51倍(P<0.05)和1.59倍(P<0.05)，在全沼液Z4處理下的蛋白質(zhì)含量顯著低于Z3處理的，但顯著大于對(duì)照(P<0.05)，是對(duì)照的1.45倍。

圖3 不同浸種處理對(duì)青菜體內(nèi)蛋白質(zhì)含量的影響

2.5沼液對(duì)青菜體內(nèi)可溶性糖含量的影響 不同處理對(duì)青菜體內(nèi)可溶性糖含量影響不同，隨著沼液施用量的增加可溶性糖含量呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)(圖4)。當(dāng)以低劑量沼液Z1處理時(shí)，可溶性糖含量是對(duì)照的1.05倍，但與對(duì)照差異不顯著(P>0.05)；隨著沼液處理劑量的增加，青菜體內(nèi)可溶性糖含量與對(duì)照相比顯著增加，其中以Z3處理最高，是對(duì)照的1.21倍(P<0.05)；當(dāng)以全沼液Z4處理時(shí)，可溶性糖含量有所降低，但與對(duì)照相比，顯著大于對(duì)照(P<0.05)，是對(duì)照的1.14倍。

圖4 不同浸種處理對(duì)青菜體內(nèi)可溶性糖含量的影響

2.6沼液對(duì)青菜體內(nèi)抗壞血酸含量的影響 AsA、DHA和總抗壞血酸變化趨勢(shì)相同(表2)。AsA含量隨著沼液處理劑量的增加與對(duì)照相比呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，在低劑量Z1處理下，AsA含量與對(duì)照相比顯著增加，是對(duì)照的1.20倍(P<0.05)；隨著沼液處理劑量的進(jìn)一步增加，AsA含量與對(duì)照相比顯著增加，分別是對(duì)照的1.43倍(P<0.05)和1.52倍(P<0.05)。在Z4處理下，AsA含量與Z3處理相比顯著降低，但顯著大于對(duì)照。同樣在低劑量Z1處理下，DHA含量是對(duì)照的1.09倍，顯著大于對(duì)照(P<0.05)；隨著沼液劑量的增加，DHA含量與對(duì)照相比顯著增加，其中Z3處理效果最好，是對(duì)照的1.57倍(P<0.05)，當(dāng)以全沼液處理的DHA含量顯著小于Z3，但顯著大于對(duì)照(P<0.05)，是對(duì)照的1.41倍?？箟难岷康淖兓厔?shì)與AsA含量和DHA含量變化趨勢(shì)相同。

表2 不同浸種處理對(duì)青菜體內(nèi)抗壞血酸含量的影響

3 討論與結(jié)論

作物的正常生長(zhǎng)需要外部提供營(yíng)養(yǎng)，本研究表明，種子浸種之后，幼苗的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量受到不同程度的影響。沼液浸種后青菜的生物量和根系活力逐漸增加，蒸餾水和沼液1∶1處理，青菜生物量與對(duì)照相比，雖然有所增加，但差異不顯著；根系活力處理顯著大于對(duì)照。隨著沼液處理劑量的增加，青菜鮮質(zhì)量、干質(zhì)量和根系活力的增加幅度也隨之增大，當(dāng)使用全沼液進(jìn)行處理后生物量和根系活力雖有所降低，但與不處理相比顯著增加。沼液浸種后能促進(jìn)青菜產(chǎn)量提高，是因?yàn)檎右褐泻胸S富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生物活性物質(zhì)[18]，這些活性物質(zhì)易于被作物吸收，向作物提供營(yíng)養(yǎng)。同時(shí)這些物質(zhì)還可以提高根系活力，促進(jìn)植物根系發(fā)育[19-20]。根系活力泛指根系整個(gè)代謝的強(qiáng)弱，包括吸收、合成、呼吸作用和氧化力等，能客觀地反映根系生命活動(dòng)，根系活力的大小與整個(gè)植株生命活動(dòng)的強(qiáng)度緊密相關(guān)[21]。而在高劑量沼液處理?xiàng)l件下，其高劑量的復(fù)合成分對(duì)青菜的生長(zhǎng)產(chǎn)生了一定的脅迫作用，導(dǎo)致青菜生長(zhǎng)和產(chǎn)量降低[22-24]。

蔬菜的品質(zhì)包括維生素、可溶性糖、氨基酸、亞硝酸鹽以及蛋白質(zhì)和礦質(zhì)元素含量等因子。其中以亞硝酸鹽、蛋白質(zhì)、可溶性糖和抗壞血酸較為重要[20]。蛋白質(zhì)含量是衡量作物營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)?？扇苄蕴窃谥参锏男玛惔x中具有重要的地位，它反映了植物體內(nèi)碳水化合物的運(yùn)轉(zhuǎn)情況，也是呼吸作用的基質(zhì)和光合作用儲(chǔ)藏能量的重要形式。維生素C作為一種高活性物質(zhì)，是人體內(nèi)不可缺少的重要維生素之一[19]。本研究表明，水葫蘆沼液浸種可以有效增加青菜體內(nèi)蛋白質(zhì)和可溶性糖含量，而降低亞硝酸鹽含量。這是因?yàn)檎右褐泻休^為豐富的氮素，在適宜的范圍內(nèi)，蔬菜糖分含量隨著施氮量的增加而增加，同時(shí)由于沼液中較多的活性物質(zhì)對(duì)作物的品質(zhì)改善有促進(jìn)作用，較高含量的有機(jī)質(zhì)增強(qiáng)植株的光合作用，加速了葉片硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)化，增加了青菜體內(nèi)蛋白質(zhì)含量，調(diào)節(jié)了青菜體內(nèi)的氮鉀比例，從而降低了植株體內(nèi)亞硝酸鹽的含量[25]。然而全沼液浸種處理使得青菜體內(nèi)蛋白質(zhì)和糖分含量降低[26]，青菜品質(zhì)受到影響。還原型抗壞血酸、脫氫抗壞血酸和總抗壞血酸含量的變化趨勢(shì)與蛋白質(zhì)和可溶性糖含量相似，還原型抗壞血酸和脫氫抗壞血酸在總抗壞血酸代謝循環(huán)過程中處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡。本研究發(fā)現(xiàn)在適宜劑量的沼液處理下，還原型抗壞血酸和脫氫抗壞血酸與對(duì)照相比均顯著增加，說明用適量的水葫蘆沼液對(duì)青菜種子進(jìn)行浸種處理，不但作物品質(zhì)得到改善，同時(shí)還增加了總抗壞血酸的代謝循環(huán)。

本研究和前期工作研究[27]發(fā)現(xiàn)，適宜劑量的水葫蘆沼液浸種不僅可以促進(jìn)種子發(fā)芽，提高發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、生物量以及葉綠素含量，還可以有效改善作物品質(zhì)，降低亞硝酸鹽含量。表明利用水葫蘆沼液浸種從理論上研究證實(shí)是可行的，但是是否能夠在實(shí)際生產(chǎn)上進(jìn)行推廣應(yīng)用，還需要通過小區(qū)試驗(yàn)來進(jìn)一步證實(shí)。

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