蘆 翔,石衛(wèi)東,王宜倫,汪 強,譚金芳,韓燕來
(1.河南農業(yè)大學資源與環(huán)境學院,河南 鄭州 450002;2.河南省科學院地理研究所,河南 鄭州 450002)
土壤鹽漬化是世界性的問題,據(jù)統(tǒng)計,全球大約有3.8億hm2土地存在不同程度的鹽漬化,約占可耕地面積的10%。中國目前有0.2億hm2以上鹽堿地和0.07億hm2以上鹽漬化土壤,約占可耕地面積的20%,嚴重影響了糧食產量,成為限制農業(yè)生產的主要因素[1-3]。
一氧化氮(NO)是生物體內的信號分子,有關NO對作物抗鹽性的調節(jié)作用已在多種作物進行過研究。前人的相關研究表明,外源的NO可緩解小麥(Triticumaestivum)葉片和根尖細胞的氧化損傷[4];緩解水稻(Oryzasativa)在鹽脅迫和高溫脅迫下葉綠素的降解,維持光系統(tǒng)Ⅱ穩(wěn)定性[5-6];緩解鹽脅迫對玉米(Zeamays)生長的抑制作用[7];減輕鹽脅迫對黃瓜(Cucumissativus)幼苗的傷害[8];提高番茄(Solanumlycopersicum)幼苗對光能利用效率,促進番茄的生長[9]。燕麥(Avenasativa)是一年生具有較高的營養(yǎng)價值的糧飼兼用型作物。與小麥相比,燕麥對鹽堿土有更好的適應性,目前被廣泛認為是鹽堿地改良的替代作物之一[10]。雖然前人對NO已做較多的研究,但外源NO對鹽脅迫下燕麥生長的調節(jié)效應及機理研究還鮮有報道。本研究利用耐鹽能力不同的2個燕麥品種為材料,探討外源NO對鹽脅迫下燕麥幼苗抗氧化酶活性及生長的影響,以了解NO緩解燕麥鹽脅迫的生理機制。
1.1供試材料 供試燕麥品種白燕6號(A.sativa‘BaiYan No.6’)和內散2號(A.sativa‘NeiSan No.2’)是吉林白城農業(yè)科學院、內蒙古農牧大學的原種,引進當?shù)睾笤谙嗤瑮l件下經一年的繁殖后備用。
1.2植株培養(yǎng) 取籽粒飽滿、大小一致的燕麥種子,用1%次氯酸鈉消毒10 min后,再用無菌水沖洗凈消毒液、然后將種子放入蒸餾水中通氣吸漲4 h,均勻放入鋪有一層吸水紙的培養(yǎng)皿中,25 ℃黑暗條件下催芽。催芽3 d后,挑選露白一致的種子,用Hongland營養(yǎng)液進行水培,于(25±1) ℃恒溫室培養(yǎng),每天光照12 h,光強72.7 μmol/(m2·s),至燕麥幼苗長至四葉一心時進行試驗。
1.3試驗方案 采用室內水培試驗,設1個對照,3個處理:1)Hoagland(CK);2)Hoagland+0.06 mmol/L 硝普鈉(SNP);3)Hoagland+150 mmol/L NaCl(NaCl);4)Hoagland+0.06 mmol/L SNP+150 mmol/L NaCl(NaCl+SNP)。重復4次。處理8 d后進行植株干質量、葉綠素含量和葉片質膜透性的測定;于處理后0、2、4、6、8 d,進行葉片抗氧化酶活性和丙二醛(MDA)含量測定。培養(yǎng)期間為保證各營養(yǎng)液濃度的相對穩(wěn)定,每天更換一次營養(yǎng)液。
1.4測定項目與方法
1.4.1植株干質量測定 取出完整植株,用蒸餾水快速沖洗去地上部分表面的灰塵,用吸水紙吸干表面水分后將材料放入90 ℃的烘箱中殺青30 min后,65 ℃烘干至質量不變,稱其干質量。
1.4.2葉片葉綠素含量和質膜透性的測定 葉綠素含量的測定參照Arnon[11]的方法。質膜透性的測定參考劉寧等[12]的方法 。
1.4.3葉片超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶、抗壞血酸過氧化物酶活性和丙二醛含量測定 葉片超氧化物歧化酶(SOD)活性按照Beauchamp和Fridovich[13]的方法測定。過氧化物酶(POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚法[14]。過氧化氫酶(CAT)活性測定參照Patterson等[15]的方法。抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性測定參照Nakano和Asada[16]的方法,葉片中MDA含量參照許長成等[17]的方法。
1.4.4數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析 利用Excel 2003和DPS 2000對相關數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。
2.1外源NO對NaCl脅迫下燕麥幼苗干質量的影響 處理后8 d,與CK相比,NaCl處理白燕6號和內散2號干質量均顯著下降(P<0.05),分別下降了26.8%和45.1%(圖1),表明白燕6號的耐鹽性相對較好,而內散2號的耐鹽性相對較弱。
與CK相比,SNP處理對燕麥幼苗生長無顯著影響(P>0.05)。與NaCl處理相比,NaCl+SNP處理均顯著提高了白燕6號和內散2號干質量(P<0.05),2個燕麥品種分別提高了18.3%和48.7%,說明外源NO對鹽脅迫下內散2號的幼苗干質量下降的緩解作用大于白燕6號。
2.2外源NO對鹽脅迫下燕麥葉片丙二醛含量的影響 CK和SNP處理時,兩燕麥品種葉片中MDA含量在8 d內保持相對穩(wěn)定,而NaCl脅迫后,兩燕麥品種MDA含量均迅速上升,脅迫期間內散2號葉片MDA含量比白燕6號MDA含量平均值高18.5%(圖2),說明NaCl脅迫下內散2號質膜氧化損傷更重。
圖1 外源NO對NaCl脅迫燕麥幼苗干質量的影響
與NaCl處理相比,NaCl+SNP處理顯著降低了兩燕麥品種葉片的MDA含量(P<0.05),特別是在處理后4和6 d,白燕6號和內散2號MDA含量均急劇下降。其中白燕6號葉片MDA含量在處理后2、4、6和8 d分別降低了14.4%、11.4%、19.1%和28.9%,平均為18.5%,內散2號葉片的MDA含量分別降低了24.9%、19.5%、23.6%和37.5%,平均為26.4%。
2.3外源NO對鹽脅迫下燕麥幼苗葉片質膜透性的影響 葉片質膜透性用葉片相對電導率表示。處理后8 d,CK和SNP處理中2個燕麥品種葉片相對電導率均較低;與CK相比,NaCl處理植株葉片相對電導率顯著增加(P<0.05),白燕6號和內散2號幼苗葉片相對電導率分別增加了286.2%和316.2%(圖3),說明鹽脅迫對內散2號的傷害更大。
與NaCl處理相比,NaCl+SNP處理燕麥幼苗葉片的相對電導率顯著降低(P<0.05),其中白燕6號和內散2號的葉片的相對電導率分別降低了33.1%和34.6%。說明在鹽脅迫下,外源NO能夠保護葉片細胞膜結構的完整性,從而使葉片質膜透性保持在相對較低的水平。
2.4外源NO對鹽脅迫下燕麥幼苗葉綠素含量的影響 處理后8 d,CK和SNP處理之間燕麥幼苗葉片葉綠素含量差異不顯著(P>0.05);與CK相比,NaCl處理白燕6號和內散2號幼苗葉片葉綠素含量均顯著下降(P<0.05),分別下降了62.7%和72.3%(圖4),說明內散2號受NaCl脅迫影響較為嚴重。
與NaCl處理相比,NaCl+SNP處理能顯著提高燕麥幼苗葉片葉綠素含量(P<0.05),白燕6號和內散2號葉綠素含量分別提高了71.9%和97.7%,表明外源NO對鹽脅迫下燕麥葉片葉綠素含量的下降有顯著的緩解作用。
圖2 外源NO對NaCl脅迫燕麥幼苗葉片丙二醛含量的影響
圖3 外源NO對NaCl脅迫燕麥幼苗葉片相對電導率的影響
圖4 外源NO對NaCl脅迫燕麥幼苗葉片葉綠素含量的影響
2.5外源NO對鹽脅迫下燕麥幼苗葉片抗氧化酶活性的影響
2.5.1外源NO對鹽脅迫下燕麥幼苗葉片SOD活性的影響 CK和SNP處理,兩燕麥品種葉片SOD活性在8 d內變化均相對較小,且同一燕麥品種兩處理之間差異不顯著(P>0.05)。NaCl處理使兩燕麥品種葉片的SOD活性在短時間內均顯著升高,并在處理后2 d達到最高水平,之后迅速下降,但脅迫8 d時,白燕6號葉片SOD活性仍大于對照處理,而內散2號葉片SOD活性已低于對照(圖5)。
與NaCl處理相比,NaCl+SNP處理明顯提高了兩燕麥品種葉片的SOD活性,其中白燕6號葉片SOD活性在處理后2、4、6和8 d分別提高了12.6%、11.5%、16.3%和20.4%,平均為15.2%,內散2號葉片的SOD活性分別提高了8.5%、21.8%、9.6%、48.3%,平均為22.0%。
2.5.2外源NO對鹽脅迫下燕麥幼苗葉片CAT活性的影響 CK和SNP處理,兩燕麥品種葉片CAT活性在8 d內變化不大,且同一品種兩處理之間差異不顯著(P>0.05)。與CK相比,NaCl處理迅速降低了兩燕麥品種葉片CAT活性,且隨著鹽脅迫時間的推移,兩燕麥品種葉片CAT活性均持續(xù)下降,在脅迫8 d時,白燕6號和內散2號燕麥葉片CAT活性分別下降了48.4%和58.7%(圖6)。
圖5 外源NO對NaCl脅迫下燕麥幼苗葉片SOD酶活性的影響
圖6 外源NO對NaCl脅迫燕麥幼苗葉片CAT酶活性的影響
與NaCl處理相比,NaCl+SNP處理顯著提高了兩燕麥品種葉片CAT活性(P<0.05),其中白燕6號葉片CAT活性在處理后2、4、6和8 d分別提高了19.0%、36.6%、32.2%和28.8%,平均為29.1%,內散2號葉片的CAT活性分別提高了29.2%、40.4%、32.1%和48.5%,平均為37.6%,但均低于CK和SNP處理。
2.5.3外源NO對鹽脅迫下燕麥幼苗葉片POD活性的影響 處理后8 d內,CK和SNP處理兩燕麥品種葉片POD活性隨時間推移均呈緩慢增加趨勢,處理之間差異不顯著(P>0.05)。與CK相比,NaCl處理后2 d時兩燕麥品種葉片的POD活性即顯著升高(P<0.05),此后隨時間的推移緩慢增加(圖7)。
與NaCl處理相比,NaCl+SNP的處理兩燕麥品種葉片的POD活性均進一步增加,其中白燕6號葉片POD活性在處理后2、4、6和8 d分別提高了8.6 %、9.5%、8.1%和5.0%,平均為7.8%;內散2號葉片的POD活性分別提高了2.4%、9.9%、7.8%和13.4%,平均為8.4%。與SNP對SOD活性、CAT活性的提高作用相比,SNP對POD活性的影響相對較小。
2.5.4外源NO對鹽脅迫下燕麥幼苗葉片APX活性的影響 鹽脅迫2 d時,白燕6號的葉片APX活性即比CK顯著增高(P<0.05),但此后增加趨勢漸緩,而內散2號在0~6 d呈緩慢增加趨勢,此后變化不大(圖8)。
與NaCl處理相比,NaCl+SNP的處理顯著提高了白燕6號和內散2號的葉片APX活性(P<0.05),并隨時間的延長提高作用趨于增強。其中白燕6號葉片APX活性在處理后2、4、6和8 d分別提高了8.6%、16.5%、8.6%和16.3%,平均為12.5%,內散2號葉片的APX活性分別提高了52.0%、38.2%、34.3%和73.3%,平均為49.5%。
圖7 外源NO對鹽脅迫燕麥幼苗葉片POD活性的影響
圖8 外源NO對鹽脅迫燕麥幼苗葉片APX活性的影響
3.1鹽脅迫對燕麥生長的影響 鹽脅迫對非鹽生植物生長抑制是鹽脅迫產生的普遍結果,然而由于鹽分脅迫反應的復雜性,其機理并不清楚。本研究中觀察到鹽分脅迫引起了葉綠素含量和干物質積累的下降,對此一般認為是,植物體內葉綠素酶可引起葉綠素的降解,而鹽分脅迫能增強葉綠素酶的活性,加速葉綠素分解[18];同時葉綠素是植物進行光合作用的重要物質基礎,鹽分脅迫可促進葉綠素的分解,進而影響到植株的光合作用及自身生長。近年來,人們又從自由基傷害學說觀點來解釋逆境對植物生長的影響,指出在鹽分脅迫條件下,需氧植物體內活性氧代謝系統(tǒng)失去平衡,自由基增加,細胞內不飽和脂肪酸在生物自由基的作用下易誘發(fā)膜脂過氧化,從而使膜的透性增加,離子外滲,引起植物代謝紊亂,生長受阻[19]。質膜相對透性的大小是膜傷害的重要標志,丙二醛則是脂質過氧化的主要產物之一[20]。本研究表明,燕麥幼苗葉片丙二醛含量隨著NaCl脅迫時間的推移顯著增加,同時在脅迫后8 d葉片細胞質膜相對透性與對照相比顯著增加。因此,結合鹽脅迫下氧自由基傷害學說可以認為,NaCl脅迫可能由于促進了活性氧的積累,造成了燕麥葉片的細胞膜損傷,同時也影響到葉綠素穩(wěn)定性并最終影響到植物光合作物和植株生長。此外,與多數(shù)試驗觀察到的丙二醛含量隨鹽脅迫時間延長而持續(xù)增加不同,本研究發(fā)現(xiàn),隨著鹽脅迫時間的延長,白燕6號在鹽脅迫4 d后,內散2號在鹽脅迫6 d后,丙二醛含量上升趨勢變緩,說明鹽脅迫引起的燕麥膜傷害反應可在一定時段保持相對穩(wěn)定性,使膜系統(tǒng)結構和功能維持某種程度的平衡,從而使葉片細胞仍能維持一定的生理功能,這一結果也可能與燕麥本身有一定的抗鹽能力有關。
3.2抗氧化酶在燕麥適應鹽脅迫反應的作用 植物體內超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶和抗壞血酸過氧化物酶等抗氧化酶類是植物體內重要的活性氧清除劑,在一定范圍內能有效地清除活性氧,維持活性氧的代謝平衡、保護膜結構,從而使植物在一定程度上忍耐、減緩或抵御逆境脅迫傷害[21]。鹽脅迫下植物的抗氧化酶活性通常會表現(xiàn)顯著的變化,但由于不同研究者使用的研究手段、供試作物品種、脅迫強度、脅迫時間的不同而得到不盡相同的結論。陳明等[4]研究表明,鹽脅迫下小麥幼苗根尖細胞中超氧化物歧化酶、過氧化物酶和抗壞血酸過氧化物酶 3種活性氧清除酶活性在鹽脅迫初期均呈上升趨勢,并隨著脅迫時間的延長又轉為下降;蘇桐等[22]研究表明,鹽脅迫下燕麥體內超氧化物歧化酶和過氧化物酶酶活性隨時間的延長先上升后下降,而過氧化氫酶酶活性則呈下降趨勢。本研究表明,NaCl處理后,超氧化物歧化酶、過氧化物酶、抗壞血酸過氧化物酶和過氧化氫酶酶活性隨時間推移變化不同。其中超氧化物歧化酶酶活性隨NaCl脅迫時間推移表現(xiàn)為快速上升后快速下降的特點,過氧化物酶和抗壞血酸過氧化物酶基本上呈持續(xù)上升的趨勢,而過氧化氫酶則表現(xiàn)持續(xù)下降,這一結果也與蘇桐等[22]的結果相似,說明燕麥在受鹽脅迫時,超氧化物歧化酶可能主要在脅迫的最初階段的氧自由基的清除中起作用,過氧化物酶和抗壞血酸過氧化物酶可在較長階段持續(xù)起作用,而過氧化氫酶酶活性可能由于對鹽脅迫較為敏感,受到脅迫后立即下降,清除氧自由基的作用相對較小。
3.3NO對鹽脅迫下燕麥耐鹽生理反應的調節(jié) NO是植物體中廣泛存在的一種正常代謝物或副產物,也是一種重要的信號分子,NO重要的生理作用即是參與氧自由基代謝的調控[23]。本研究表明,鹽脅迫時加入硝普鈉的處理,耐鹽性不同的兩燕麥品種葉片超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶、抗壞血酸過氧化物酶活性均有明顯增加,說明不論對耐鹽性高的品種或是耐鹽性差的品種,硝普鈉均可提高鹽脅迫下植株氧自由基清除系統(tǒng)的活性。同時還觀察到,鹽脅迫時加入硝普鈉的處理在提高抗氧化酶活性的同時可顯著降低燕麥葉片丙二醛含量和葉片質膜相對透性,由于丙二醛是膜脂過氧化產物,葉片質膜相對透性是質膜受傷害的重要標志,因此可以推測,硝普鈉很可能也是由于提高了NaCl脅迫下燕麥抗氧化酶活性,減少了活性氧的產生,從而有助于緩解NaCl脅迫對燕麥幼苗的氧化傷害作用。此外,硝普鈉的加入在降低鹽脅迫下葉片丙二醛含量的同時,亦增加了葉綠素含量和干物質積累,盡管有人認為,NO提高葉綠素的含量的具體原因有可能是因為激活了葉綠素生物合成過程中的某些酶類,但本研究中NO在提高了抗氧化酶活性和降低葉片丙二醛含量的同時,亦增加了葉綠素含量和干物質積累,所以也不能排除NO可直接通過降低活性氧的積累而減少葉綠素的分解從而增加干物質積累的可能。本研究還表明,鹽脅迫時加入硝普鈉對不同抗氧化酶活性影響不同,其中對超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和抗壞血酸過氧化物酶活性影響較大,而對過氧化物酶活性影響相對較小,說明NO對不同抗氧化酶的調節(jié)作用是不同的,具體原因有待進一步研究。
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