任蓓蕾 史小莉 閆世梁 崔鳳霞

（鄭州拓洋實(shí)業(yè)有限公司技術(shù)中心，河南 鄭州 450066）

D-核糖（D-Ribose，D-R）是一種具有重要生理意義的五碳糖，廣泛應(yīng)用于食品及醫(yī)藥工業(yè)，是目前合成維生素B2的重要原料，也可用于合成抗病毒、抗腫瘤的藥物[1]。它的生產(chǎn)方法主要有三種，一是抽提法，二是化學(xué)合成法，三是生物發(fā)酵法。前兩種因其產(chǎn)率低、成本高、環(huán)境污染大等諸多問題，在規(guī)?；a(chǎn)中基本上被淘汰，而生物發(fā)酵法是葡萄糖利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)，因其成本低、易于大規(guī)模生產(chǎn)、環(huán)境污染較小等優(yōu)點(diǎn)[2],已得到國內(nèi)外D-核糖生產(chǎn)廠家的普遍采用。D-核糖發(fā)酵是磷酸戊糖途徑(I-IMP)的非氧化支路缺失，使微生物改變酶系，積累阻斷反應(yīng)的前體來進(jìn)行代謝控制發(fā)酵的[3]，但D-核糖產(chǎn)生菌--枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)酮醇酶變異株常常會受到噬菌體的污染而使生產(chǎn)受到影響，抗噬菌體菌株的選育是發(fā)酵工業(yè)噬菌體防治的重要方法之一。國外已將菌株的抗噬菌體特性作為評價(jià)或篩選發(fā)酵劑優(yōu)良菌株的重要標(biāo)準(zhǔn)[4]。為此，我們從D-核糖的異常發(fā)酵液中分離純化了噬菌體并開展了抗噬菌體菌株的選育工作，本文報(bào)道了此項(xiàng)研究結(jié)果。

1 材料和方法

1.1 材料。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）轉(zhuǎn)酮醇酶（Transketolase）變異株 XB02，本公司自備。

噬菌體P001，本公司異常發(fā)酵液中分離純化而得。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 肉湯培養(yǎng)基

牛肉膏0.5%、蛋白胨1.0%、可溶性淀粉2.0%、NaC1 0.5%、酵母膏0.1%，pH值7.0-7.2，加入瓊脂2.0%則為固體培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基用于細(xì)菌和噬菌體的保藏、擴(kuò)增及活化等。

1.2.2 噬菌體培養(yǎng)基

上層培養(yǎng)基配比：淀粉1%，精解蛋白胨0.2%，NaC1 0.1%，NaNO30.1%，K2HPO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001%，瓊脂 1%，pH 7.8-8.0；

下層培養(yǎng)基配比：牛肉膏0.3%，蛋白胨1.0%，NaC1 0.5%，瓊脂2.0%，pH 7.4-7.5。

1.2.3 種子培養(yǎng)基

葡萄糖2.0%、酵母膏0.35%、K2HPO40.3%、KH2PO40.1%，pH7.0-7.2。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖20%、玉米漿3%、(NH4)2SO40.6%、CaCO3 3.6%、MnSO4·4H2O 0.005%。pH 7.0-7.2。

1.3 培養(yǎng)方法

?

敏感菌株、抗性菌株及噬菌體在肉湯培養(yǎng)基或雙層瓊脂培養(yǎng)基上的培養(yǎng)溫度為35±0.5℃，培養(yǎng)時間為24h。噬菌體原液的制備、搖瓶種子培養(yǎng)及發(fā)酵均在旋轉(zhuǎn)式搖床上進(jìn)行，培養(yǎng)溫度為 35±0.5℃，轉(zhuǎn)速 220rpm，培養(yǎng)周期分別為24、20和72h。

50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)條件：溫度為35±0.5℃，罐壓為 0.1Mpa，攪拌轉(zhuǎn)速為 400rpm，通氣量為 1：0.5v/v/m。

1.4 噬菌體的分離純化、原液制備及效價(jià)測定

取D-核糖異常發(fā)酵液4000r/min離心20min。上清液經(jīng)微孔濾膜過濾除菌得到含有噬菌體的樣液，然后在雙層瓊脂平板上進(jìn)行噬菌體的分離。噬菌體的分離、純化及原液制備參照文獻(xiàn)[5，6]。噬菌體效價(jià)測定采用雙層平板法[7]。

1.5 抗噬菌體菌株的選育方法

1.5.1 抗噬菌體菌株的篩選

抗噬菌體菌株的選育方法采用紫外線誘變法。從活化好的敏感菌斜面中刮出菌苔，制成單細(xì)胞懸浮液。在直徑6cm的培養(yǎng)皿中加入3mL單細(xì)胞懸浮液，放人暗箱并用電磁攪拌器進(jìn)行攪拌，在l5w紫外燈下距離（20cm 、25cm）照射(15、20、25s)(紫外燈先預(yù)熱 20min，使其波長穩(wěn)定)。黑暗中靜置30min后，取菌懸液1mL接入種子培養(yǎng)基中，同時加入噬菌體液1mL(108pfu/m1)，搖床振蕩培養(yǎng)24h后取培養(yǎng)液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，將其涂布于肉湯培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，挑取單菌落用劃線點(diǎn)滴法[8]測定其對噬菌體的抗性，同時對其進(jìn)行鏡檢，挑選出既具有抗性又與出發(fā)菌株相似的菌株。將這些菌株分別接入種子培養(yǎng)基中，同時加入噬菌體混合培養(yǎng)。比較上述菌株在搖瓶發(fā)酵中的產(chǎn)D-核糖能力，最后選出既有穩(wěn)定抗性又高產(chǎn)的菌株作為目的菌株。

1.5.2 抗性菌株遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

將選育獲得的抗性菌株分別含噬菌體的液體種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行連續(xù)傳代。每次傳代后用雙層瓊脂法、35±0.5℃培養(yǎng)48h做抗性檢查。在低倍鏡下觀察是否出現(xiàn)噬菌斑。

1.6 測定方法

D-核糖含量的檢測采用苔黑酚法[9]。菌體生長量(OD值)的測定：用蒸餾水稀釋發(fā)酵液10倍，以蒸餾水作空白，用721分光光度計(jì)測定發(fā)酵液在590nm處的光密度。

2 結(jié)果與討論

2.1 噬菌體的分離純化和濃縮

經(jīng)多次分離、純化，從D-核糖的異常發(fā)酵液中獲得了一種噬菌體，將其命名為P001，它在雙層瓊脂平板上可產(chǎn)生一種形態(tài)基本一致的噬菌斑。P001的噬菌體為透明的邊緣清晰的圓形噬菌斑，直徑約2.4mm左右。將純化后的噬菌體加入已接菌的種子培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，可以得到效價(jià)達(dá)1000pfu/mL以上的噬菌體原液。

2.2 抗噬菌體菌株的選育

以枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)酮醇酶變異株XB02為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外線誘變法誘變，得出最佳誘變工作參數(shù)為：采用15W紫外燈 (預(yù)熱20min)下，距離25cm照射25S。獲得了16株對噬菌體P001具有抗性的變異菌株，挑選出生長正常產(chǎn)D-核糖能力、生長狀況與出發(fā)菌株相近的菌株5株。經(jīng)多次復(fù)篩獲得了2株抗噬菌體的D-核糖高產(chǎn)菌株Kp03、Kp14。菌株Kp03、Kp14在噬菌體存在的條件下產(chǎn)D-核糖水平達(dá)到了對照敏感株的正常產(chǎn)D-核糖水平（如表1）。

2.3 菌株Kp03、Kp14抗噬菌體能力的檢測

將菌株Kp03、Kp14及敏感株XB02分別接入混有0.2 mL噬菌體原液（效價(jià)1000pfu/mL）的種子液中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)。在整個培養(yǎng)過程中，敏感菌株XB02的生長受到明顯抑制，并產(chǎn)生大量的噬菌體，培養(yǎng)液中噬菌體的濃度最高可達(dá)1005pfu/mL以上。而抗株Kp03、Kp14表現(xiàn)正常，對試驗(yàn)濃度下的噬菌體P001具有明顯的抗性。

2.4 抗噬菌體菌株的遺傳穩(wěn)定性

在噬菌體P001存在的條件下。對抗株Kp03、Kp14進(jìn)行搖瓶種子培養(yǎng)和發(fā)酵試驗(yàn)，考察了多次傳代后抗株的種液OD值及發(fā)酵產(chǎn)D-核糖能力；結(jié)果表明抗株Kp03在種子培養(yǎng)及發(fā)酵中出現(xiàn)異?，F(xiàn)象，遺傳穩(wěn)定性差。而抗株Kp14在種子培養(yǎng)及發(fā)酵過程中均未出現(xiàn)抗性改變的現(xiàn)象，具有較好的遺傳穩(wěn)定性，鏡檢也未發(fā)現(xiàn)異常情況。

2.5 抗噬菌體菌株的發(fā)酵性能測定

按敏感菌株XB02的發(fā)酵條件，在生產(chǎn)環(huán)境中噬菌體大量存在的情況下，在50 L的發(fā)酵罐上對抗株Kp14進(jìn)行了連續(xù)5批次的發(fā)酵試驗(yàn)(表2)。結(jié)果表明，在發(fā)酵過程中，抗株Kp14與敏感株XB02的正常發(fā)酵大致相同，未出現(xiàn)受噬菌體污染的跡象。從產(chǎn)D-核糖能力上看，抗株Kp14這5批次的平均發(fā)酵轉(zhuǎn)化率達(dá)到了50.61%，平均D-核糖產(chǎn)量達(dá)91.48 g/L，平均發(fā)酵周期52 h，與未受噬菌體污染的敏感株XB02基本相當(dāng)。

結(jié)論

本文對D-核糖產(chǎn)生菌--枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)酮醇酶變異株XB02抗噬菌體菌株的選育進(jìn)行了研究，通過紫外誘變得到了遺傳特性穩(wěn)定、發(fā)酵性能與出發(fā)菌株相似的抗株Kp14。但要把該抗株放心地用于工業(yè)生產(chǎn)，還要對它的最適發(fā)酵培養(yǎng)基、發(fā)酵的工藝條件等進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

[1]邱蔚然,高淑紅.發(fā)酵法生產(chǎn) D-核糖[J].工業(yè)微生物，2003，30(1)：58-64.

[2]Sasajima K，Yoneda M.Carbohydrate metabolism-mutants of a Bacillus species part II.D -ribose accumulation by pentose phosphate pathway mutants[J].Agr Biol Chem，1971，35(4)：509-517.

[3]王樹慶，張?jiān)伱罚瑥埧诵?D-核糖高產(chǎn)菌株的選育[J].工業(yè)微生物，2OO2，32(2)～22-25.

[4]呂加平,于景華,駱承庠.乳酸菌發(fā)酵劑優(yōu)良菌種的選育 [J]中國乳品工業(yè) ，2002，30(5)：49-53.

[5]余茂劾,司揮東.噬菌體實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京：科學(xué)出版社.1991.

[6]LU Z，BREIDT F J，F(xiàn)LEM IN G H P，et a1.Isolation and Characterization of a Lactobacillus Plantarum Bacteriophage,L-1，from a Cucumber Fermentation [J].IntemationalJournal ofFood Microbiology，2003(84)：225-235.

[7]范秀容,沈 萍.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京：高等教育出版社.1988：l02.

[8]余茂效，那淑敏，董扣洪，等.抗噬菌體產(chǎn)a-淀粉酶菌株的選育 [J].微生物學(xué)報(bào)，1986，26(3)：232.237.

[9]彭其安，張西峰，吳思方，等.同源重組法構(gòu)建枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)酮酶缺失突變菌株 [J].生物技術(shù)，2006，16(6)：23-16.