熊瑩喆 曹苑青 肖玲慧 李招發(fā)

（1. 華僑大學(xué)分子藥物研究院，泉州 362021；2. 華僑大學(xué)生物醫(yī)學(xué)學(xué)院，泉州 362021）

基于核糖開關(guān)的新型基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)的應(yīng)用

熊瑩喆 曹苑青 肖玲慧 李招發(fā)

（1. 華僑大學(xué)分子藥物研究院，泉州 362021；2. 華僑大學(xué)生物醫(yī)學(xué)學(xué)院，泉州 362021）

核糖開關(guān)是能對細(xì)胞環(huán)境的改變做出反應(yīng)的順式作用元件，通過改變自身的構(gòu)象實(shí)現(xiàn)對基因表達(dá)的調(diào)控。基于核糖開關(guān)調(diào)控方式簡潔，無需蛋白質(zhì)參與，響應(yīng)迅速，且自身片段小，結(jié)構(gòu)簡單，易于設(shè)計(jì)和改造等特性使其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域體現(xiàn)出諸多應(yīng)用優(yōu)勢。對核糖開關(guān)的結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)機(jī)理以及這種新型基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)在基因治療、抗生素新靶點(diǎn)的開發(fā)、病毒疫苗的安全控制、新型核糖選擇器和生物體內(nèi)傳感器的應(yīng)用進(jìn)行了綜述，旨為啟示我國核糖開關(guān)的新型應(yīng)用。

核糖開關(guān)；基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)；機(jī)理

核糖開關(guān)（riboswitch）是一段長度為34-200 bp的天然核苷酸序列，多存在于mRNA的5'非編碼區(qū)（5'UTR）或3'非編碼區(qū)（3'UTR），它是通過特異性結(jié)合配體進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控的順式作用元件。2002年，Winkler等［1］發(fā)現(xiàn)硫胺素衍生物結(jié)合mRNA某結(jié)構(gòu)元件后能直接調(diào)節(jié)細(xì)菌基因表達(dá)，同年，Nahvi等［2］也證實(shí)了這類mRNA非編碼區(qū)的某些結(jié)構(gòu)元件具有調(diào)控基因表達(dá)的能力，之后關(guān)于這些RNA結(jié)構(gòu)元件的研究便迅速發(fā)展，并將這些RNA結(jié)構(gòu)元件命名為核糖開關(guān)。在短短的十幾年里，已經(jīng)在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)不少于20種天然存在的核糖開關(guān)，并且它們在與一系列小分子配體結(jié)合后能廣泛參與基因的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后的修飾以及翻譯等調(diào)控作用。

大多數(shù)的基因調(diào)節(jié)機(jī)制都涉及到蛋白質(zhì)的參與，然而核糖開關(guān)這種mRNA的調(diào)控元件無需蛋白質(zhì)參與，就能直接與環(huán)境中的小分子代謝物、第二信使、tRNA、離子、維生素和氨基酸結(jié)合，調(diào)控下游的基因表達(dá)，且調(diào)控基因的能力與蛋白質(zhì)相比毫不遜色［3］。這種簡單且高效的新型基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)使核糖開關(guān)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出特有的優(yōu)勢。本文綜合國內(nèi)外核糖開關(guān)的最新研究進(jìn)展，對核糖開關(guān)的結(jié)構(gòu)機(jī)理，特別是在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行了介紹，旨為啟示開發(fā)人工高效的新型核糖開關(guān)，開辟其新型應(yīng)用。

1 核糖開關(guān)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

核糖開關(guān)一般由兩部分組成：（1）適體結(jié)構(gòu)域（aptamer domain），作為感應(yīng)器結(jié)合特異性的配體；（2）表達(dá)平臺域（expression platform），位于適體結(jié)構(gòu)域的下游，作為效應(yīng)器調(diào)控基因的表達(dá)。兩部分由作為傳送器的轉(zhuǎn)換序列（switching sequence）連接［4］。適體與配體結(jié)合后，適體結(jié)構(gòu)域構(gòu)象發(fā)生改變，這種變化的信號通過轉(zhuǎn)換序列傳遞給表達(dá)平臺域，從而進(jìn)行相應(yīng)的基因表達(dá)調(diào)控［5］。核糖開關(guān)控制的基因通常參與細(xì)胞的關(guān)鍵代謝途徑，所以能特異性結(jié)合配體的適體結(jié)構(gòu)域序列通常高度進(jìn)化保守，不容易發(fā)生基因突變［6］。

能與核糖開關(guān)結(jié)合的配體有很多，每一種配體分子需要與之完全匹配的獨(dú)特的適體結(jié)構(gòu)，另外，屬于同一類型的不同細(xì)菌中的核糖開關(guān)常?？梢哉{(diào)節(jié)不同基因的表達(dá)。因此，核糖開關(guān)在二級或三級結(jié)構(gòu)上必然有巨大的差異性。根據(jù)結(jié)構(gòu)特征的不同，我們可以將大多數(shù)核糖開關(guān)分為兩類，連接型核糖開關(guān)（junctional riboswitch）和假結(jié)型核糖開關(guān)（pseudoknoted riboseitch）［7］。連接型核糖開關(guān)是由連接點(diǎn)與幾個(gè)徑向的螺旋連接在一起的結(jié)構(gòu)，如嘌呤（purine）核糖開關(guān)［8］和TPP核糖開關(guān)［9］。假結(jié)型核糖開關(guān)是由RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)與外側(cè)部分通過堿基對連接的結(jié)構(gòu)，如SAM-Ⅱ核糖開關(guān)［10］、氟化物（fluoride）核糖開關(guān)［11］以及PreQ1核糖開關(guān)［12］。

2 核糖開關(guān)的調(diào)控機(jī)制

2.1 核糖開關(guān)的配體

核糖開關(guān)結(jié)構(gòu)的多樣性使它能識別多種不同結(jié)構(gòu)的配體。最常見的結(jié)合配體是輔酶及其衍生物，如焦磷酸硫胺素（TPP）和黃素輔酶黃素單核苷酸（FMN）等［13］，其次是嘌呤及其衍生物，如鳥嘌呤（Gua）［13］和環(huán)二鳥苷（c-di-GMP）［14］。另外，氨基酸如賴氨酸（Lys）也可作為結(jié)合配體［13］。而最小的配體家族是金屬離子配體，如Mg2+，近年來發(fā)現(xiàn)Ni2+/Co2+，Mn2+也可以結(jié)合核糖開關(guān)［15，16］。除此之外，還有一群被稱為“孤核糖開關(guān)”（orphan riboswitch）［17］的與核糖開關(guān)功能極其類似的mRNA元件，目前沒有已鑒定的配體，但也有研究表明這種孤核糖開關(guān)能感應(yīng)一些新型的化學(xué)物質(zhì)，如ATP［18］。

2.2 基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制

核糖開關(guān)基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)通常存在3種調(diào)節(jié)機(jī)制：轉(zhuǎn)錄終止型、翻譯的起始或抑制型以及自身剪切作用型［19］。

轉(zhuǎn)錄終止型核糖開關(guān)通常在結(jié)合配體后會形成一個(gè)終止子發(fā)夾結(jié)構(gòu)以終止轉(zhuǎn)錄的繼續(xù)［20］，但是當(dāng)配體濃度降低，無法與核糖開關(guān)適體域充分結(jié)合時(shí)，表達(dá)平臺域會轉(zhuǎn)換終止子發(fā)夾結(jié)構(gòu)成為抗終止子結(jié)構(gòu)，于是轉(zhuǎn)錄激活，可以繼續(xù)轉(zhuǎn)錄。另外，部分核糖開關(guān)的轉(zhuǎn)錄終止也涉及到了Rho因子的參與。Rho因子是存在于原核生物中具有解旋酶活性的轉(zhuǎn)錄蛋白，當(dāng)它結(jié)合到RNA轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中隨著轉(zhuǎn)錄一起移動，識別終止信號后，可使新產(chǎn)生的RNA從RNA-DNA轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中釋放出來，從而可以使轉(zhuǎn)錄提前終止［21］。FMN核糖開關(guān)在大腸桿菌中表達(dá)上游ribB基因就是運(yùn)用這種調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行的［22］。

翻譯的起始或抑制型核糖開關(guān)中，表達(dá)平臺域的結(jié)構(gòu)改變與核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）聯(lián)系在一起。配體與適體域結(jié)合與否，會改變表達(dá)平臺域的構(gòu)象，使RBS暴露或屏蔽進(jìn)而決定翻譯的起始或抑制。SAM-Ⅱ核糖開關(guān)就是在S-甲硫氨酸（SAM）結(jié)合適體結(jié)構(gòu)域后屏蔽RBS，抑制翻譯的典型例子［23］。而存在于創(chuàng)傷弧菌mRNA的腺嘌呤核糖開關(guān)則是在配體結(jié)合后暴露SD序列（原核生物中的RBS序列），開始翻譯［24］。

自身剪切作用型核糖開關(guān)是基于表達(dá)平臺域具有核酶活性，在與配體結(jié)合后，能催化自我剪切RNA，使RNA降解，斷裂或重新拼接。6-磷酸葡糖胺合成酶（GlmS）核糖開關(guān)就是具有核酶活性的核糖開關(guān)，當(dāng)與配體6-磷酸葡糖胺（GlcN6P）結(jié)合后，GlmS核酶被激活剪切GmlS RNA，使mRNA 5'端三磷酸帽子結(jié)構(gòu)降解，暴露出5'-OH基團(tuán)，極易被核糖核酸酶（RNase J1）識別并降解GlmS mRNA［25］。

3 核糖開關(guān)的應(yīng)用

3.1 基因治療的新型調(diào)節(jié)方式

基因治療是指通過基因工程的方法將外源基因引入患者的受體細(xì)胞，從根本上糾正受體細(xì)胞有缺陷的基因，或通過外源基因表達(dá)的產(chǎn)物治療某些疾病，在臨床試驗(yàn)中已經(jīng)取得重大成功［26］。實(shí)時(shí)調(diào)控基因表達(dá)水平是基因治療的關(guān)鍵，外源基因表達(dá)過多或過少都不能使治療達(dá)到理想狀態(tài)。目前常用的是轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)［27］，而轉(zhuǎn)錄因子這種蛋白質(zhì)調(diào)控方式需將編碼相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的基因與治療基因一起轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，異源蛋白的免疫毒性便是首要考慮問題，其次，調(diào)節(jié)元件的復(fù)雜結(jié)構(gòu)和過大體積，響應(yīng)調(diào)節(jié)信號不夠靈敏，響應(yīng)時(shí)間長，這些都限制了其臨床應(yīng)用［28］。相比之下，核糖開關(guān)這一新型基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)具有多種應(yīng)用優(yōu)勢：第一，核糖開關(guān)是一段少于200 bp的核苷酸序列，不需要啟動子元件，結(jié)構(gòu)簡單，易于改造與設(shè)計(jì)；第二，核糖開關(guān)對基因表達(dá)的調(diào)控不需要輔助因子，減少了免疫原性；第三，核糖開關(guān)的引發(fā)配體都是簡單的小分子或離子，降低了開發(fā)應(yīng)用成本，如乳糖誘導(dǎo)體系就比IPTG這種誘導(dǎo)劑便宜很多；第四，大多數(shù)核糖開關(guān)的配體都可以直接穿入細(xì)胞壁或細(xì)胞膜，使核糖開關(guān)對細(xì)胞所處環(huán)境改變的反應(yīng)更靈敏，調(diào)節(jié)效率更高；第五，核糖開關(guān)位于mRNA中，是一種順式作用元件，可使調(diào)節(jié)更緊密。隨著環(huán)境中配體濃度的改變，核糖開關(guān)可以相應(yīng)的啟動或抑制基因表達(dá)，這種新型且簡單的調(diào)控方式使核糖開關(guān)為基因治療提供了新的研究思路［29］。例如，用核糖開關(guān)調(diào)節(jié)T細(xì)胞內(nèi)白介素-2（IL-2）和白介素-5（IL-5）基因的表達(dá)從而控制T細(xì)胞增殖的研究［30］。另外，也有研究表明，核糖開關(guān)在基因治療中確實(shí)具有良好的效果，已達(dá)臨床試驗(yàn)階段［31］，這也使核糖開關(guān)在基因治療的應(yīng)用方面受到廣泛的關(guān)注。

3.2 抗生素開發(fā)的新靶點(diǎn)

隨著日益嚴(yán)重的細(xì)菌耐藥性問題，尋找可以優(yōu)化傳統(tǒng)抗生素對抗細(xì)菌的方法迫在眉睫［32］。由于大多數(shù)核糖開關(guān)存在于原核生物中，且其調(diào)控的基因通常是致病菌生存或致病的關(guān)鍵基因，使得核糖開關(guān)可以作為抗生素研究的新靶點(diǎn)［33］。相比于傳統(tǒng)的抗生素，核糖開關(guān)擁有更低的人體細(xì)胞毒性，因?yàn)槟壳斑€沒有在高等哺乳動物細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)核糖開關(guān)。其次，核糖開關(guān)的配體通常是小型復(fù)合物、簡單的代謝物和離子等，易于改造和設(shè)計(jì)，也方便進(jìn)出細(xì)胞應(yīng)用于基因調(diào)控系統(tǒng)，這為開發(fā)新型抗生素奠定了基礎(chǔ)。另外，核糖開關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域序列高度進(jìn)化保守，一種類型的核糖開關(guān)可存在于多種細(xì)菌中，且單一的突變不會影響抗菌效果，抗菌范圍更廣闊。因此，核糖開關(guān)在抗生素新靶點(diǎn)的開發(fā)與應(yīng)用領(lǐng)域具有良好的前景。目前已發(fā)現(xiàn)的可應(yīng)用于抗生素新靶點(diǎn)的核糖開關(guān)分為5種［13］：TPP核糖開關(guān)、FMN核糖開關(guān)、Lys核糖開關(guān)、Gua核糖開關(guān)和glmS核酶核糖開關(guān)。近年來在抗生素耐藥性的細(xì)菌病原體中還發(fā)現(xiàn)了廣泛存在的氨基糖苷類結(jié)合核糖開關(guān)［34］，為新型抗生素核糖開關(guān)靶點(diǎn)提供了又一研究方法。在藥物治療方面，我們還需要尋找更多的配體及其類似物，以及在沒有配體存在下用其他化合物誘導(dǎo)核糖開關(guān)，為核糖開關(guān)這一抗生素新靶點(diǎn)的研究提供了更多的思路。

3.3 病毒疫苗的安全開關(guān)

研究發(fā)現(xiàn)一些病毒會傾向于感染并殺死腫瘤細(xì)胞，于是被稱為“溶瘤病毒”（oncolytic viruses），將這種溶瘤病毒注入人體內(nèi)治療腫瘤，其安全性和可控性是首要考慮問題，而用于控制病毒以防其在治療期間產(chǎn)生副作用的抗病毒藥物僅在極少數(shù)病毒藥物中起作用。因此，找到一種能有效控制溶瘤病毒的致病性和其他副作用的安全開關(guān)是迫切需要的［35］。核糖開關(guān)是一種能被小分子配體誘導(dǎo)的新型基因調(diào)控元件，利用基因工程的方法在病毒基因中插入核糖開關(guān)，經(jīng)藥物誘導(dǎo)實(shí)時(shí)控制病毒的復(fù)制、侵染及細(xì)胞毒性。這種基于核糖開關(guān)的基因安全開關(guān)能廣泛應(yīng)用于DNA或RNA病毒，使新型活病毒疫苗的安全性進(jìn)一步提高。在2014年已報(bào)道了核糖開關(guān)可成功應(yīng)用于控制人類致病性病毒：腺病毒和麻疹病毒的功能系統(tǒng)［36］。Ketzer等［36］將具有自切割核酶活性的人工適體酶核糖開關(guān)插入腺病毒的基因，致使病毒僅在腫瘤細(xì)胞中具有復(fù)制能力。該核糖開關(guān)可以在沒有配體結(jié)合的情況下啟動基因表達(dá)，而在加入茶堿配體后，核酶轉(zhuǎn)換為活性構(gòu)象并開始mRNA的自切割，從而抑制基因表達(dá)。研究表明，該核糖開關(guān)關(guān)閉了腺病毒E1A基因的表達(dá)后，可使病毒復(fù)制減少約200倍。這項(xiàng)研究同樣適用于麻疹病毒，在加入茶堿配體后，麻疹病毒的復(fù)制在48 h后減少了50倍。這是核糖開關(guān)第一次成功應(yīng)用于人類致病性病毒的研究?；诤颂情_關(guān)這種結(jié)構(gòu)簡單的RNA固有調(diào)控元件，將會是真核基因表達(dá)系統(tǒng)中誘導(dǎo)型啟動子的第一備選。

3.4 高產(chǎn)代謝物菌株的核糖選擇器（riboselectors）

微生物工程是利用微生物生產(chǎn)對人類有用的產(chǎn)品的一類技術(shù)，然而大多數(shù)目標(biāo)產(chǎn)物沒有典型的特征，不易被常規(guī)的篩選工具識別而不能獲?。?7］。由于核糖開關(guān)是對細(xì)胞內(nèi)代謝物的濃度產(chǎn)生快速反應(yīng)的基因表達(dá)調(diào)控元件，能特異性感應(yīng)不易篩選的代謝物，其與目標(biāo)代謝物結(jié)合后，核糖開關(guān)適體結(jié)構(gòu)域構(gòu)象發(fā)生改變，然后將信號傳遞給下游基因，在篩選壓力下僅使目的細(xì)胞存活，這種基于核糖開關(guān)而設(shè)計(jì)的選擇裝置稱之為“核糖選擇器”［38］。目前已成功應(yīng)用于大腸桿菌中的Lys核糖開關(guān)［39］，將Lys核糖開關(guān)與TatA基因篩選模型［40］聯(lián)合應(yīng)用，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)賴氨酸與Lys核糖開關(guān)結(jié)合后，可抑制下游篩選基因-tatA基因的表達(dá)，使已在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)積累豐富賴氨酸的細(xì)胞在Ni2+的存在下可以存活，即在Ni2+的篩選壓力下得到賴氨酸含量豐富的細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)表明，在這種篩選系統(tǒng)中，賴氨酸的產(chǎn)率可在4輪篩選之后成功增長75%［39］。綜上所述，基于核糖開關(guān)這種新型基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)的核糖選擇器，是篩選高產(chǎn)目的代謝物菌株的有效手段。

3.5 體內(nèi)傳感器

生物傳感器可檢測多種生命物質(zhì)或化學(xué)物質(zhì)，識別一種給定物質(zhì)后通常會引起一系列的電化學(xué)反應(yīng)或光學(xué)信號用于進(jìn)一步的分析。目前常用的是酶生物傳感器，但其價(jià)格昂貴，分離純化目標(biāo)物質(zhì)操作復(fù)雜，研究者們期望能在細(xì)胞內(nèi)找到一種固有且穩(wěn)定的生物傳感器［41］。核糖開關(guān)是RNA固有的順式作用元件，能通過適體結(jié)構(gòu)域的一小段序列識別小分子配體，將信號傳遞給表達(dá)平臺域調(diào)控下游基因的表達(dá)。通常可在體外通過配體指數(shù)富集系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）從頭合成所需要的適體，然后設(shè)計(jì)成為核糖開關(guān)的適體域，理論上應(yīng)用SELEX技術(shù)能篩選到自然界幾乎所有靶分子的適體［42］。例如，用核酶核糖開關(guān)作為體內(nèi)傳感器檢測酵母細(xì)胞內(nèi)代謝物的含量變化情況，在適體域與黃嘌呤結(jié)合后，下游綠色熒光蛋白（GFP）基因能順利表達(dá)，通過檢測GFP的變化便可分析黃嘌呤的含量變化［43］。這種人工設(shè)計(jì)的核糖開關(guān)與天然核糖開關(guān)相似，并能與低濃度配體結(jié)合，響應(yīng)更靈敏，在生物傳感器領(lǐng)域擁有廣闊的應(yīng)用前景。

4 展望

從核糖開關(guān)的發(fā)現(xiàn)至今的十幾年時(shí)間里，核糖開關(guān)這種新型基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)在多個(gè)生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中展現(xiàn)出無可比擬的應(yīng)用優(yōu)勢。為了設(shè)計(jì)出更理想的人工核糖開關(guān)，我們需要注意幾個(gè)方面：（1）目前高等哺乳動物體內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)核糖開關(guān)，可能是核糖開關(guān)存在潛在的免疫反應(yīng)，前不久就有報(bào)道稱核糖開關(guān)可以激活人體固有免疫因子PKR［44］；（2）人工設(shè)計(jì)的配體可能不容易進(jìn)入宿主細(xì)胞固有代謝物的代謝途徑；（3）部分天然存在的核糖開關(guān)可能在一定的背景條件下才會發(fā)揮作用，如溫度和pH等。同時(shí)，我們還需要進(jìn)一步探索和認(rèn)識核糖開關(guān)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，以及核糖開關(guān)識別配體的機(jī)制，為設(shè)計(jì)新型核糖開關(guān)，尋找靶向配體奠定基礎(chǔ)。本文所涉及的核糖開關(guān)的應(yīng)用只是核糖開關(guān)廣泛應(yīng)用前景中的冰山一角，更多的新型核糖開關(guān)及其應(yīng)用還有待開發(fā)，在未來的生物醫(yī)學(xué)、藥物治療等領(lǐng)域，核糖開關(guān)這種天然RNA調(diào)控元件及其新型基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)必將發(fā)揮巨大作用。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Applications of Riboswitch-based Novel Regulation System of Gene Expression

XIONG Ying-zhe CAO Yuan-qin XIAO Ling-hui LI Zhao-fa
（1. Institution of Molecular Medicine，Huaqiao University，Quanzhou 362021；2. School of Biomedical Science，Huaqiao University，Quanzhou 362021）

Riboswitches are cis-acting elements that can respond to the environmental changes of the cell by altering its conformation to achieve the regulation of gene expression. Due to its characteristics of simple regulation system without proteins involved，response fast，short sequences with simple structure，and easy to design and modify，applying it in biomedical area should be in superiority. The review addresses the advance of the structure and regulation mechanism of riboswitches，as well as the applications of this novel regulation system of gene expression in gene therapy，the development of novel target for antibiotic，the safety switch for virus vaccine，and the new riboselectors and biosensors，aiming at inspiring the application of riboswitches in China.

riboswitch；regulation system of gene expression；mechanism

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.006

2016-04-29

福建省引導(dǎo)性項(xiàng)目（2016Y0063），福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2013J01381），中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)資助項(xiàng)目（JB-ZR1142）

熊瑩喆，女，碩士，研究方向：病毒檢測；E-mail：xiongyingzhe@hqu.edu.cn

李招發(fā)，男，博士，副教授，研究方向：基因工程，生物藥物；E-mail：lizhaofa@hqu.edu.cn