孫真鄭亮邱浩斌

（1. 合肥工業(yè)大學(xué)，宣城 242000；2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；3. 萍鄉(xiāng)學(xué)院工程與管理學(xué)院，萍鄉(xiāng) 337000）

植物根際促生細(xì)菌定殖研究進(jìn)展

孫真1鄭亮2邱浩斌3

（1. 合肥工業(yè)大學(xué)，宣城 242000；2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；3. 萍鄉(xiāng)學(xué)院工程與管理學(xué)院，萍鄉(xiāng) 337000）

植物促生菌（plant grwth-promoting bacterium，PGPB）因可有效抑制根際病原菌，促進(jìn)植物生長，增加作物產(chǎn)量等作用，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大前景。以了解植物根際促生細(xì)菌的種類，理解定殖相關(guān)的促生機制為目的，展示了根際細(xì)菌的定殖過程及影響細(xì)菌在根部定殖的因素，通過抗生素標(biāo)記、免疫學(xué)方法、外源基因標(biāo)記等方法進(jìn)行定殖微生物的檢測，以高通量測序技術(shù)在根際定殖中的廣泛應(yīng)用為結(jié)果，得出結(jié)論應(yīng)從遺傳水平上對菌株進(jìn)行解讀，獲得植物根際土壤微生物群落多樣性，功能基因等研究，這項工作對預(yù)測根際促生細(xì)菌與植物的交互作用，生物菌劑的田間應(yīng)用有重要意義，應(yīng)是植物根際促生細(xì)菌今后的研究方向。

定殖；根際菌；促生；高通量測序

促生微生物與植物生長之間關(guān)系密切，其具有可抑制植物病原菌發(fā)生、促進(jìn)植物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收等功能。植物根際促生細(xì)菌兼具促進(jìn)植物生長并控制病害發(fā)生的功能，成為有機農(nóng)業(yè)發(fā)展的希望［1，2］。固氮作用、礦物質(zhì)溶解、植物生長素釋放等都是根際細(xì)菌促生的重要途徑。但將實驗室條件下促生效果顯著的微生物應(yīng)用到野外卻不能發(fā)揮好的效果［3］。無論是溫室或野外條件，微生物在根部的定殖過程都非常復(fù)雜，定殖研究將為根際細(xì)菌在復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)提供新視角，對生物菌劑的田間應(yīng)用提供重要的理論支持。目前，越來越多的研究篩選并證實植物促生菌（plant grwth-promoting bacterium，PGPB）具有促生防病效果［4］。據(jù)此，筆者總結(jié)了植物根際促生細(xì)菌的種類、促生機制及定殖微生物的檢測方法、影響微生物在根部定殖的因素等，認(rèn)為傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合可以更好的跟蹤PGPB在根際的變化及所在生境的微生物群落演替規(guī)律，這對于更好的預(yù)測PGPB與植物的交互作用，以及生物菌劑的田間應(yīng)用有重要意義。

1 植物根際定殖菌的種類

國內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、固氮菌屬（Azotobacter）、腸桿菌屬（Enterobacter）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、伯克氏菌屬（Burkholderia）等20多個種屬具有促生防病潛能，研究最多是假單胞菌屬、芽孢桿菌屬［5］?？莶菅挎邨U菌PTS-394［6］、芽孢桿菌YPP-9［7］均可定殖番茄根際，有效預(yù)防番茄枯萎病，枯草芽孢桿菌FB17［8］可發(fā)揮運動性、產(chǎn)生根系分泌物有效定殖擬南芥根系。巨大芽孢桿菌C4［9］在玉米、水稻根部有效定殖。解淀粉芽孢桿菌NJN-6［10］定殖香蕉根部促進(jìn)生長。B.malacitensis Z-5［11］、B.subtilis GB03、B.amyloliquefaciens IN937a、B.polymyxa E681［12］、B.cereus［13，14］定殖寄主根系。綠針假單胞菌O6［12］產(chǎn)生揮發(fā)性代謝產(chǎn)物，如水楊酸和茉莉酸，并以產(chǎn)物為信號誘導(dǎo)植物產(chǎn)生免疫反應(yīng)。熒光假單胞菌CV6可產(chǎn)IAA、嗜鐵素、結(jié)瘤及拮抗作用促進(jìn)黃瓜生長［15］。P.fluorescens 92rkG5［16］及P.aeruginosa IE-6S［17］定殖于番茄根部，前者依賴于根系分泌物，后者對逆境則有較好的耐性。假單胞菌DSMZ13134［18］可定殖于大麥根部且溫室和大田的定殖特征相似。P.putida和P.fluorescens［19］通過天仙子堿和莨菪堿有效定殖。

生癌腸桿菌定殖于木豆根際［13］，陰溝腸桿菌［3］定殖于水稻根部。水生拉恩氏菌HX2，可溶磷并產(chǎn)生IAA，定殖于葡萄、番茄、向日葵根部［20］。醋桿菌屬G.diazotrophicus［2］定殖于高粱和小麥根系，滋養(yǎng)節(jié)桿菌Ar13［21］防效達(dá)46.60%，定殖于綠豆根際。向日葵根際篩選出伯克氏菌（Burkholderia sp.）、固氮螺菌（Azospirillum sp.）、志賀氏桿菌（Shigella sp. ）、新鞘脂菌（Novosphingobium sp.）、無色菌（Achromobacter sp.）等，均可產(chǎn)生鐵細(xì)胞，新鞘脂菌、伯克氏菌、無色菌、固氮螺菌產(chǎn)生吲哚類物質(zhì)，伯克氏菌和無色菌則具有溶磷作用［22］?？死装资蠗U菌NG14［23］通過nifH基因在水稻根系定殖參與固氮作用。草螺菌［24］（H. frisingense）定殖大麥根系，草螺菌RAM10［25］利用piIT基因控制菠蘿上的定殖。根瘤菌［26］定殖于大豆根系，其定殖能力受脅迫環(huán)境影響減弱。Boehm［27］發(fā)現(xiàn)固氮弧菌BH72菌株通過piIT基因控制在水稻根部的定殖能力。根瘤菌ORS-571、固氮菌MTCC-446可通過結(jié)瘤、固氮、耐性等促進(jìn)植物生長［28］。蒼白桿菌KUDC1013［29］定殖后可利用系統(tǒng)誘導(dǎo)抗性（ISR）和脂多糖誘導(dǎo)（LPS）抵御軟腐病害。伯克氏菌KJ006的群體感應(yīng)信號可防治水稻谷枯?。?0］。

植物-微生物體系是一個完整的微生態(tài)系統(tǒng)，植物體內(nèi)、體表和根際均分布大量的微生物，盡管PGPB在這一體系可發(fā)揮有益作用，其他微生物的種群和數(shù)量同樣對植物的產(chǎn)量、品質(zhì)、防病等具有極大影響，且其群落結(jié)構(gòu)和數(shù)量也處于不斷變化。以往PGPB的根際定殖研究多集中在單一或某幾類微生物在根際的定殖效果，常見于從根際中篩選具有促生功能的細(xì)菌類群，且此類研究多由于田間應(yīng)用效果而受到限制。了解根際定殖菌的種類，尤其是對該生態(tài)系統(tǒng)其他微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，對于田間促生效果的發(fā)揮具有重要意義。

2 定殖相關(guān)的促生機制

目前，PGPB的研究還集中在微生物在根際的促生防病機制［31］，見表1。產(chǎn)生刺激性植物激素、揮發(fā)性化合物、ACC脫氨酶等，降低植物體乙烯水平，改進(jìn)植物營養(yǎng)狀況（如促進(jìn)難溶性磷、鉀和微量元素的釋放及非共生固氮等）及誘導(dǎo)植物產(chǎn)生ISR均屬于直接促生作用。間接促生作用則包括，產(chǎn)生抗生素、抗菌蛋白或鐵載體等減輕病害，加強共生作用（根瘤和菌根的形成），降解農(nóng)藥等生物外源性物質(zhì)。

熒光假單胞菌（P. fluorescens）FPT9601-T5及賽維瓦爾芽孢桿菌（P. thivervalensis）MLG45均可產(chǎn)生IAA，緩解定殖菌在寄主植物生理進(jìn)程中受到的環(huán)境壓力，直接刺激植物增長［32］。部分定殖菌可產(chǎn)乙烯，或利用外源乙烯和其前體ACC抑制病原菌感染，或形成根瘤，通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)定殖［33］。部分PGPB產(chǎn)生鐵細(xì)胞可螯合三價鐵離子，能與LPS發(fā)生ISR［22］。水楊酸（SA）、茉莉酸（JA）可作為信號誘導(dǎo)植物產(chǎn)生免疫反應(yīng)來調(diào)控微生物的定殖［12］。輔助因子吡咯喹啉醌（PQQ）與ISR輔助子相關(guān)［34］。細(xì)胞分裂素（CTK）促進(jìn)根細(xì)胞分裂、增大根表面積，來影響菌株的定殖數(shù)量，赤霉素刺激葉芽生長，改變植物形態(tài)來影響定殖［35］。

表1 PGPB及定殖相關(guān)的生物學(xué)特征

熒光假單胞菌WCS365野生型菌株和非營養(yǎng)缺陷的Tn5隨機轉(zhuǎn)座突變株的根尖定殖對比試驗表明細(xì)菌運動性相關(guān)基因可影響定殖［36］。運動性和對根分泌物的趨化性是細(xì)菌的重要定植特性，如蘋果酸內(nèi)酯是生防枯草芽孢桿菌FB17菌株的主要化學(xué)引誘物［8］。非特異性磷酸酶、植酸酶和C-P 裂解酶分解土壤中有機磷化合物以釋放可溶性磷，無機磷酸鹽中可溶性磷的釋放與有機酸形成有關(guān)。QS信號擴散由N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯（AHLs）和N-3-羰基六?；呓z氨酸內(nèi)酯（HSL）兩種物質(zhì)傳遞［37］。 蒼白桿菌KUDC1013利用ISR抵御軟腐病害，colR/S系統(tǒng)、LPS氧化位點、鞭毛等都參與ISR［29］。piIT基因［25，27］可控制菌毛收縮，缺失該基因的突變體喪失抽搐運動性，影響菌株定殖能力。

綜上所述，IAA、乙烯、ACC脫氨酶、鐵細(xì)胞、赤霉素、細(xì)胞分裂素、水楊酸、茉莉酸、類黃酮及細(xì)胞脫落酸等物質(zhì)均可參與調(diào)控根際微生物定殖，此類分泌物的產(chǎn)生通常是細(xì)菌或植物體內(nèi)編碼基因及酶的調(diào)控。生物固氮、溶磷、群體感應(yīng)、ISR機制、NADH脫氫酶、LPS氧化位點、IV-菌毛及抽搐運動性等機制也可調(diào)控植物的定殖，此類機制是否發(fā)生效應(yīng)除了依靠信號分子外，基因的作用至關(guān)重要。因此，在植物根際促生菌研究中，除了回答所在生境有何物種，哪些物種有促生作用，生境中微生物群落的演替變化、還需要弄清楚這些物種具有怎樣的基因功能，各種促生機制如何發(fā)揮作用，則需要高通量測序技術(shù)，尤其是宏基因組學(xué)在PGPB研究中的應(yīng)用。

3 根際細(xì)菌的定殖過程及影響因素

土壤接種微生物后單個零星細(xì)胞先到達(dá)根系表面，成對的包裹于整個根被皮，并成線狀排列于表面，后密集覆蓋于整個根系，甚至在寄主植物上形成包裹的生物膜。根表細(xì)菌的侵入多依靠被動方式，可通過側(cè)根裂隙、氣孔、水孔及莖皮孔等自然開口，以及因土壤摩擦、動物取食或人為傷害的傷口進(jìn)入。如筆者將接種了HX2gfp的幼苗根部，用水沖洗在顯微鏡下能觀察到大量菌株，同時進(jìn)行消毒處理后制成冰凍切片，橫截面卻未觀測到菌株，該細(xì)菌僅定殖于根表［39］。內(nèi)生細(xì)菌多以主動方式侵入，不但在根圍成功定殖還可進(jìn)入植物體內(nèi)，從根部一直侵染到莖、葉、花和果實等部位，發(fā)揮促生效應(yīng)［33］。如巨大芽孢桿菌C4［9］，熒光假單胞菌92rkG5［16］，內(nèi)生細(xì)菌01-144［38］，與根表細(xì)菌相比，內(nèi)生細(xì)菌對寄主要求更高、專一性更強。

PGPB的定殖受一系列生物環(huán)境因素影響，包括根系分泌物、植物生長狀況、細(xì)菌趨化性、自我調(diào)節(jié)機制及細(xì)菌營養(yǎng)型等。如香蕉根系分泌物吸引解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）NJN-6定殖［10］，假高粱根系分泌物對PGPB的定殖有選擇性［40］。植物改變根系建筑學(xué)結(jié)構(gòu)可誘導(dǎo)不同種群定殖［41］，根系伸長速率影響假單胞菌積累［42］。此外，細(xì)菌通過遺傳控制鞭毛/運動性、趨化性、多糖、位點特異重組酶/菌落階段變異、NADH脫氫酶、根系分泌物和植物種類［43］，水生拉恩示菌pqq和gdh基因被破壞后生防效果降低［21］，細(xì)菌B3-7重新獲得運動性基因時定殖生防能力恢復(fù)［44］。同時，番茄根部易分化部位的熒光假單胞菌92rkG5與根尖的細(xì)菌生理型不同［16］。PGPB能否定殖，還受到土壤溫度、質(zhì)地、含水量、襯質(zhì)勢及含氧量等非生物因素的影響。如干旱脅迫影響大豆根際接種多黏類芽孢桿菌（P. polymyxa）及熱帶根瘤菌（R. tropici）的定殖［26］，低溫下植物生長緩慢，土壤空隙可為根際菌提供保護(hù)位點，細(xì)菌擴散借助于水分，合適的氧氣、氯化鈉濃度、鐵含量可促進(jìn)銅綠假單胞菌（P. aeruginosa）IE-6S［17］在番茄的定殖。因此，多種外界因素影響著根際菌競爭能力的發(fā)揮。

PGPB定殖特征具有普遍性，其影響因素也被眾多學(xué)者認(rèn)可。然而，涉及微生物遺傳層面，影響PGPB定殖的因素如何與自身的基因功能作用，對相應(yīng)的細(xì)菌基因進(jìn)行注釋，了解定殖菌的代謝通路并進(jìn)行功能注釋則需要研究者更多的探索。

4 定殖微生物的檢測方法

植物根際促生細(xì)菌的定殖檢測方法包括抗生素標(biāo)記、免疫學(xué)方法及外源基因標(biāo)記等?？股貥?biāo)記法可保持原始菌株的穩(wěn)定遺傳性，抗利福平和抗病原真菌法鑒定出B. malacitensis Z-5有效定殖棉花根際［11］。免疫學(xué)方法包括熒光標(biāo)記免疫，酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）等。例如，ELISA方法證明PRPG菌株可減少黃瓜花葉病毒對番茄類植物的感染［45］。外源及標(biāo)記基因多為編碼酶的基因，通過檢查表達(dá)產(chǎn)物來監(jiān)測定殖狀況，此類基因包括lacZ（編碼大腸桿菌的β-半乳糖苷酶）、gusA（編碼大腸桿菌的β-葡萄糖醛酸糖苷酶）、luxAB（編碼細(xì)菌熒光素酶）和gfp（綠色熒光蛋白基因）。目前，使用最多的還是gfp標(biāo)記，該方法不需要底物及輔助因子即能表達(dá)，對細(xì)胞及組織無毒害作用，穩(wěn)定性好，有多種顏色和強度的突變體［46］。如標(biāo)記了gfp基因的枯草芽孢桿菌PTS-394在番茄根際有效定殖［6］，筆者通過電擊轉(zhuǎn)入帶有g(shù)fp表達(dá)的質(zhì)粒pSMC21，在488 nm激發(fā)波長下觀察到HX2gfp菌株為亮綠色熒光短桿狀菌體［39］。另外，根據(jù)gfp基因的特點還可使用基因探針、分子雜交、PCR等分子生物學(xué)方法。

各種微生物的定殖檢測方法可明確微生物在植物根際定殖的機制和微生物定殖的特性，在微生物與環(huán)境相互作用具有較好的應(yīng)用價值，其中分子生物方法對于PGPB在根際的定殖研究起到了重要的推動作用。

5 高通量測序技術(shù)在根際定殖中的應(yīng)用

21 世紀(jì)以來，人類基因組計劃開啟大數(shù)據(jù)時代，各國研究者對微生物的研究已從形態(tài)特征分析、生理生化分析、分子生物學(xué)技術(shù)這些傳統(tǒng)手段向高通量測序技術(shù)分析逐漸轉(zhuǎn)化，隨著高通量測序技術(shù)和數(shù)據(jù)處理能力的發(fā)展，目前研究包括：針對rRNA為主要對象的群落多樣性研究；以環(huán)境中所有遺傳物質(zhì)為對象的群落功能研究及以環(huán)境中所有轉(zhuǎn)錄本為對象的群落轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律研究。

針對16S rRNA的微生物群落多樣性研究有助于準(zhǔn)確分析定殖在植物根際和非根際土壤的細(xì)菌組成和分布，測序的結(jié)果能夠更加深入地了解細(xì)菌群落組分在科、屬和OUT水平上的變化。如利用16S rRNA對南極洲維管束植物根際土壤細(xì)群落的研究［47］，利用rRNA測序發(fā)現(xiàn)施用生物有機肥可調(diào)節(jié)根際中微生物群落結(jié)構(gòu)，增強黃瓜枯萎病的抵抗力［48］。以環(huán)境中所有遺傳物質(zhì)為對象的群落功能研究，除了有微生物的分類信息外更包含了環(huán)境中微生物的全部基因信息，有助于對群落潛在的功能進(jìn)行挖掘，可通過測序序列找到特定環(huán)境下富集的功能基因。固氮菌等廣泛分布于植物根際，兼具促生、抑制病原菌可定殖于植物根系，如利用高通量測序獲得了土壤中涉及β-內(nèi)酰胺酶的細(xì)菌功能類群，這些類群決定了土壤細(xì)菌對藥物的抗性［49］。利用MiSeq平臺的高通量測序雖獲得nifH固氮菌［50］、nirS反硝化菌［51］根際的群落多樣性，卻較少涉及根際中影響N元素代謝途徑的調(diào)控基因，以及根際中涉及固氮功能的組學(xué)研究。以環(huán)境中所有轉(zhuǎn)錄本為對象的群落轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律研究，可實時、實地的反映微生物群落的基因表達(dá)，如對解淀粉芽孢桿菌SQR9的全轉(zhuǎn)錄組分析表明，該菌株定殖根部期間，受玉米分泌物影響生物膜的形成能力增強［52］。

6 展望

目前，篩選新的可定殖于植物根際的促生菌株研究、利用gfp基因展示促生菌在植物根系的遷移運動規(guī)律、判定PGPB促生機制的種類，以及實驗室條件下PGPB對植物的促生防病效果研究，雖豐富了PGPB的數(shù)據(jù)庫給農(nóng)業(yè)應(yīng)用帶來希望，但越來越多的同類型研究報道已難在高質(zhì)量期刊上占有一席地位，依靠高通量測序等技術(shù)對涉及定殖行為的基因調(diào)控研究，以及根際中影響菌株代謝途徑的宏基因組學(xué)研究逐漸成為熱點。弄清楚實驗室環(huán)境下的促生防病效果顯著的PGPB難以在自然環(huán)境下發(fā)揮功效的原因仍具有巨大挑戰(zhàn)，首先弄清限菌與大田環(huán)境根際微生物的群落差異，通過引入PGPB根據(jù)微生物群落的變化，找到影響PGPB效果發(fā)揮的關(guān)鍵類群，進(jìn)一步優(yōu)化菌株的田間應(yīng)用效果。此外，加深涉及定殖性狀的基因研究，了解信號分子如何在定殖過程發(fā)揮調(diào)控作用，以及一系列中間產(chǎn)物的遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律也將促進(jìn)PGPB在農(nóng)業(yè)的應(yīng)用。

因此，利用高通量測序技術(shù)從遺傳水平上對菌株進(jìn)行解讀，獲得植物根際土壤微生物群落多樣性，功能基因及代謝通路分析有助于加深研究者對植物-根際菌相互關(guān)系的理解，傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)、生理學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)的結(jié)合，對于更好的預(yù)測PGPB與植物的交互作用，解決PGPB在田間與限菌條件下定殖能力的差異，推動生物菌劑的商業(yè)化發(fā)展意義重大，應(yīng)為未來研究主要方向。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research Advances on Colonization of Plant Growth-promoting Rhizobacteria

SUN Zhen1ZHENG Liang2QIU Hao-bin3
（1. Hefei University of Technology，Xuancheng 242000；2. East China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Shanghai 200090；3. College of Engineering and Management，Pingxiang University，Pingxiang 337000）

The PGPB（plant growth-promoting bacterium）presents a promising prospect in agriculture due to its advantages such as inhibiting rhizosphere pathogens，promoting plant growth，and increasing crop production. This paper first summarizes the species of plant growth-promoting rhizobacteria and the promoting mechanisms of involved colonization，and demonstrates the colonization process of rhizobacteria as well as the factors influencing the colonization of bacteria in rhizosphere. Then the paper reviews the detection methods of microorganisms in the colonization of bacteria，including antibiotics marking，immunological methods，and exogenous gene marking methods. Further，the paper discusses high-throughput sequencing technologies widely used in the rhizosphere colonization. Finally，it is concluded that the future researches on interpreting strains in genetic level，gaining microbial community diversity in plant rhizosphere and the functional genes should be of significance to better predict the interaction of PGPB and its host plant，and to apply bio-fertilizers in field.

colonization；rhizobacteria；growth-promoting；high-throughput sequencing

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.002

2016-05-11

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金資助項目（JZ2015HGBZ0527），合肥工業(yè)大學(xué)2016年度“學(xué)術(shù)新人提升A計劃”項目（JZ2016HGTA0682）

孫真，女，博士，研究方向：微生物生態(tài)；E-mail：sunzhen@hfut.edu.cn