汪學(xué)英，孫明偉，顧 鋒，吳金男，尹 凡

（常熟理工學(xué)院 化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500）

微生物對食品的污染問題是我國乃至全世界食品安全中最突出的問題.牛奶營養(yǎng)豐富，但易腐敗、變質(zhì)[1]，其中含有很多潛在的有害微生物，這些微生物可以破壞牛奶質(zhì)量，危害飲用者身體健康[2-4].細菌總數(shù)既是評價牛奶質(zhì)量最重要的污染指標之一，也是最主要的質(zhì)量控制項目，建立及時、準確、快速、適用于奶站收購時“卸載”檢測的牛奶中微生物檢測方法是牛奶衛(wèi)生檢驗中的一個十分重要的內(nèi)容.

傳統(tǒng)的微生物檢測技術(shù)非常繁瑣，需要耗費大量的人力物力，而且檢測周期長、靈敏度低，難以滿足目前國內(nèi)外對食品安全檢測的要求[5，6].串連式壓電傳感器因具有穩(wěn)定、靈敏、操作簡便等優(yōu)點[7，8]，已被應(yīng)用于微生物的檢測[9，10]，但已有的文獻都集中在串連式壓電傳感器對單一菌種的測定[11-13].本實驗是基于在微生物作用下牛奶發(fā)生凝結(jié)，使牛奶的粘密度發(fā)生變化從而使石英晶體諧振頻率發(fā)生突變，而凝固的時間與牛奶中微生物的初始濃度存在線性關(guān)系，因此通過檢測牛奶凝結(jié)時間可以實現(xiàn)對牛奶中總菌數(shù)的間接測定.本方法的準確性與傳統(tǒng)的平板計數(shù)法相當，但更快速、簡便.

1 材料與方法

1.1 實驗儀器

石英晶體微天平（QCM922，Seiko，Japan）、9MHz的 AT切型石英晶片（Seiko，Japan）；凈化工作臺 S·SW-CJ·2F型（上海博泰實驗設(shè)備有限公司）；全自動不銹鋼雙層立式電熱蒸汽壓力消毒器YX.400Z型（上海三申醫(yī)療器械有限公司）；電熱恒溫干燥培養(yǎng)箱303A-3S型（上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司）；PHS－3C型pH計（上海精密儀器廠）.

1.2 實驗材料

菌種：嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）由常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院發(fā)酵工程技術(shù)研究中心提供.

培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL，121℃高壓滅菌20分鐘.牛奶：常熟市圣力乳業(yè)有限公司和市售.實驗所用水均為二次蒸餾水.

1.3 實驗方法

儀器檢測：用濃硫酸和雙氧水（3:1）的混合液處理電極表面，蒸餾水沖洗凈后吹干，連同檢測池在75%酒精中浸泡，無菌水沖洗，加入一定量的滅菌牛奶.檢測電極插入檢測池中，待溫度達到設(shè)定溫度時，用無菌微量進樣器或吸量管向檢測池中接入不同濃度的細菌懸液，開機檢測.設(shè)定每5 min一個點，跟蹤測定，得到一系列數(shù)據(jù).

平板實驗：標準平板計數(shù)實驗同步進行，作為對照.對樣品進行梯度稀釋，取合適的稀釋樣1 mL于無菌培養(yǎng)皿中，每梯度做3個平行，加入融化并冷卻至50℃的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基并搖勻，待凝固后置于37℃的培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h，然后對平板上的菌落進行計數(shù)，推算樣品中細菌濃度.

以上操作均于無菌環(huán)境中進行.

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗原理

壓電傳感器不僅對質(zhì)量敏感，而且對液體的力學(xué)性質(zhì)，如粘度、密度、應(yīng)力、彈性模量等的變化也非常敏感[7].壓電石英晶體諧振頻率的改變值與介質(zhì)的密度和粘度之間的關(guān)系可用如下公式[7]表示：

上式表明，△f隨（ρLηL）1/2增加而降低（式中ρL、ηL分別為介質(zhì)的密度和粘度，ρq為石英晶體密度，μq為石英剪切模量）.

作為液相介質(zhì)的鮮乳在微生物作用下發(fā)酵產(chǎn)酸，牛奶的流變性和粘度發(fā)生變化，從而產(chǎn)生凝結(jié)現(xiàn)象.由于粘、密度增大，引起壓電晶體石英晶振的頻率下降.當開始凝結(jié)時頻率急降，這個頻率急降的轉(zhuǎn)折點定義為檢測時間（FDT）.微生物含量越多，到達FDT所需的時間越短，兩者存在如下關(guān)系[7]：

圖1為牛奶凝結(jié)的典型頻率響應(yīng)曲線.其中曲線a是無菌的空白對照組，b、c為在滅菌奶中約加入含4.2×105cfu/mL嗜熱鏈球菌后的典型頻移曲線.開始由于細菌剛接種到牛奶中，處于適應(yīng)期，所以代謝十分緩慢，頻率基本不發(fā)生變化.一段時間后，細菌進入指數(shù)生長期，細菌大量繁殖，在細菌作用下，牛奶發(fā)酵產(chǎn)酸而凝結(jié)，此時頻率開始急劇下降，直線1、2所對應(yīng)的為約含4.2×105cfu/mL嗜熱鏈球菌的牛奶在37℃和21℃時的頻率檢測時間（FDT）.空白組由于沒有細菌加入，所需凝結(jié)時間較長，在21℃時10小時仍未觀察到凝結(jié)現(xiàn)象；而當有約4.2×105cfu/mL細菌存在時，37℃時牛奶的凝結(jié)時間僅為1.5小時左右（見曲線c），而21℃時約需6小時才開始凝結(jié)（見曲線b）.由此可見，培養(yǎng)條件不同，F(xiàn)DT也不同.只有在培養(yǎng)條件相同、傳代速度穩(wěn)定時，細菌初始數(shù)目越大FDT值才越小，因此相同條件下可以通過測定頻率發(fā)生變化的時間來間接測定細菌的初始數(shù)目.

圖1 牛奶凝結(jié)的典型曲線

2.2 實驗條件的選擇

壓電傳感器用于生物反應(yīng)液相檢測過程受到多種因素的影響，常見的影響因素如溶液的離子濃度、粘度、密度、pH值、體積、溫度等[14].故本文實驗選取對細菌生長及活性影響較大的pH值和溫度進行探討.

露置牛奶在空氣中一定的時間以使細菌滋生，在9 ml的滅菌牛奶中加入1 ml上述處理的牛奶，在不同溫度下考察其頻率響應(yīng)曲線，結(jié)果見圖2.由圖2可以看出，溫度對細菌的活性影響較大，曲線a、b、c、d分別為30℃、37℃、42℃和45℃時細菌的生長頻率曲線.隨著溫度的升高，F(xiàn)DT逐漸減小.造成這一結(jié)果可能的原因是隨著溫度的升高，細菌增殖速度較快，大量產(chǎn)酸，使牛奶迅速凝結(jié)，介質(zhì)的流變性、粘密度發(fā)生變化.另外溫度的變化對測定介質(zhì)-牛奶的理化特性也有一定的影響.但溫度太高儀器不太穩(wěn)定，故實驗選取42℃作為檢測溫度.

檢測介質(zhì)的初始pH值對檢測時間FDT也有較大的影響.在9 ml滅菌牛奶中加入1 ml含菌牛奶，用檸檬酸和檸檬酸鈉固體調(diào)節(jié)pH值，圖3為不同pH值下相同濃度細菌的頻移曲線，從圖3可以看出，pH值對實驗結(jié)果有較大的影響. 曲線c（pH＝7.4）、d（pH＝8）斜率較曲線a（pH＝5.6）、b（pH＝6.8）大，說明介質(zhì)的pH值越大，頻率下降越快，且最大頻移也較大.而pH值為6.8時的FDT最?。ㄝ^pH＝5.6時的FDT縮短了約140分鐘），說明此時牛奶中的主要細菌生長較旺盛.實驗選取了FDT較短時的pH值為6.8的介質(zhì)為實驗介質(zhì).

圖2 不同溫度下細菌的頻移曲線

圖3 不同pH下相同濃度的細菌的頻移曲線

實驗還考察了無機鹽對檢測時間的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本實驗中無機鹽用量對測定結(jié)果無顯著影響.

2.3 細菌含量的測定

圖4為在選定的實驗條件下，采用方法1.3對接種了不同濃度細菌后的試樣進行測定所得到的頻率變化曲線，從圖4可以看出，加入細菌量越多，牛奶凝結(jié)所需的時間越短，即FDT越小.實驗測試了一系列含不同濃度細菌的鮮乳，得到了校準曲線的線性方程為：

FDT（min）=662.36-94.75lgc（cfu/mL），R=-0.9963

上式中的C是檢測液中細菌的初始濃度，F(xiàn)DT是頻率檢出時間，相關(guān)系數(shù)為0.9963，在細菌濃度為5.5×102-1×106cfu/mL范圍內(nèi)，F(xiàn)DT和細菌濃度的對數(shù)成良好的線性關(guān)系.根據(jù)上述公式，就可以由實驗得到的FDT值計算出被檢樣品的細菌含量.

實驗中所使用的細菌儲備液的濃度由平板計數(shù)法獲得，系列濃度的菌液由儲備液用滅菌乳稀釋一定倍數(shù)而成.

圖4 不同濃度細菌的頻率響應(yīng)曲線

2.4 本文方法與平板計數(shù)法的比較

取5份牛奶樣品（市售），分別用壓電傳感器和平板計數(shù)法同時進行測定.先用平板計數(shù)法對5份樣品進行檢測.然后使用本文方法對每個奶樣平行測定5次，取其平均值與平板計數(shù)法的結(jié)果進行比較，結(jié)果見表1.

表1 本文方法與平板計數(shù)法測定結(jié)果（n=5）

從表1數(shù)據(jù)可以看出，用兩種方法測定5個樣品的最大相對偏差為6.94%；同時也可計算出t=2.1207，當自由度v=n-1=4，由 v=4查 t值表得 t值：t0.05（4）=2.776，t0.01（4）=4.604，今 t＜t0.05，故兩種方法差異不顯著，說明本文方法用于牛奶中細菌總數(shù)的測定是可行的.

3 結(jié) 論

本文應(yīng)用壓電傳感器測定了牛奶中總菌數(shù)，樣品不需要預(yù)處理，操作方便、靈敏、檢出限低，并與傳統(tǒng)的平板計數(shù)法所得實驗數(shù)據(jù)無顯著差異.但本方法由于檢出時間的讀取存在誤差，且不同類型的細菌其響應(yīng)特征有所不同，因此，對混合細菌的測定可能存在一定的誤差，但本方法作為牛奶初步篩選的方法，可大大縮短檢測時間，在微生物的快速檢測中具有優(yōu)勢.

[1]ABDULLAH D A，SABRY A H.Bacterial quality of raw milk investigated by Escherichia coli and isolates analysis for specific virulence-gene markers[J].Food Control，2009，20:913-917.

[2]JOHNSON E A，NELSON J H，JOHNSON M.Microbiological safety of cheese made from heat-treated milk.Part I.Executive summary，introduction and history[J].J Food Prot，1990，53:441-452.

[3]HAYES M C，RALYEA R D，MURPHY S C，et al.Identification and characterization of elevated microbial counts in bulk tank raw milk[J].J Dairy Sci，2001，84:292-298.

[4]GRUETZMACHER T J，BRADLEY R L.Identification and control of processing variables that affect the quality and safety of fluid milk[J].J Food Prot，1999，62:625-631.

[5]HALL R H.Biosensor technologies for detecting microbiological foodborne hazards[J].Microbes Infect，2002，4（4）:425-432.

[6]PATEL P D.Overview of affinity biosensors in food analysis[J].J AOAC Int，2006，89:805-818.

[7]姚守拙.壓電化學(xué)與生物傳感[M].長沙：湖南師范大學(xué)出版社，1997:268-271，402.

[8]SHEN D Z，ZHU W H，NIE L H，et al.Behavior of a series piezoelectric sensor in electrolyte solution:Part I.Theory[J].Anal Chim Acta，1993，276（1）:87-97.

[9]DENG L，YAO S Z.On-line rapid detection of urease producing bacteria with a novel bulk acoustic wave ammonia sensor[J].Enzy Microbio Tech，1997，21（4）:258-264.

[10]ZHAO J W，ZHU W J，HE F J.Rapidly determining E.coli and Paeruginosa by an eight channels bulk acoustic wave impedance physical biosensor[J].Sensors&Actuators B，2005，107:271-276.

[11]劉素芹，戴高鵬，王啟會.快速檢測牛奶中大腸桿菌的壓電生物傳感器研究[J].食品科學(xué)，2009，30（4）:207-209.

[12]袁河清，李萍，劉有勝.壓電體聲波生物傳感器檢測食品中的結(jié)核桿菌[J].食品科學(xué)，2009，30（2）:201-203.

[13]劉素芹，戴高鵬，王啟會.串聯(lián)電極陣列壓電傳感技術(shù)自動檢測病原體[J].傳感器與微系統(tǒng)，2009，28（4）:66-68.

[14]張波，府偉靈，蔣天倫，等.壓電石英晶體傳感器液相檢測的影響因素[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2002，24（1）:8-11.