童海龍

（青海省門(mén)源縣青石嘴獸醫(yī)站，青海 門(mén)源 810301）

本次檢測(cè)對(duì)門(mén)源縣某雞場(chǎng)已經(jīng)過(guò)新城疫免疫的雞群進(jìn)行新城疫抗體水平監(jiān)測(cè)。該雞場(chǎng)有零星散發(fā)的雞只死亡的情況出現(xiàn)，通過(guò)病理表現(xiàn)及（HA）實(shí)驗(yàn)檢疫，所發(fā)病雞為新城疫感染，考慮到該場(chǎng)已作過(guò)新城疫免疫接種，采用（HI）實(shí)驗(yàn)詳細(xì)了解該場(chǎng)新城疫抗體水平，并作出相應(yīng)處理措施以進(jìn)一步深入防止新城疫病毒的入侵。

1 材料

1.1 試驗(yàn)儀器

注射器、玻棒、96孔微量板、微量加樣槍、恒溫水浴箱、冰箱、針頭、試管、微型震蕩器、離心機(jī)。

1.2 試驗(yàn)試劑

生理鹽水、枸櫞酸鈉抗凝劑、任氏液、1%的雞紅細(xì)胞。

1.3 診斷抗原

新城疫病毒。

2 方法

2.1 血液樣品的處理

在養(yǎng)雞場(chǎng)隨機(jī)采血樣60份，對(duì)其進(jìn)行編號(hào)，保存于10℃左右，在3天之內(nèi)，將血樣以3000 r/min離心10min，將上層的血清吸入干凈的離心管中，置于4℃下保存。

2.2 枸櫞酸鈉抗凝劑的制備

先稱(chēng)取檸檬酸鈉3.8 g粉末，加入100mL蒸餾水定容，裝瓶，121℃高壓滅菌15min，得到的抗凝劑濃度為3.8%。

2.3 單位抗原的配制

先從冰箱中取出保存的凍干的濃縮抗原，將其放在室溫條件下待完全溶化。與2mL蒸餾水稀釋溶化后，通過(guò)血凝試驗(yàn)測(cè)其抗原效價(jià)，以能引起100%血凝的病毒最高稀釋度作為抗原的效價(jià)，此稀釋度為1個(gè)HA單位抗原。例如血凝終點(diǎn)滴度為1:512，則4個(gè)單位的稀釋度為1:128，將1mL抗原加入127mL生理鹽水，即為4單位抗原[3]。

2.4 配制1%的紅細(xì)胞懸浮液

隨機(jī)選取3只成年公雞，從頸靜脈采血，總共采100mL，并將其迅速加入含有枸櫞酸鈉抗凝劑的空容量瓶中，輕輕振蕩使血液與枸櫞酸鈉充分混勻。取10mL血液和90mL生理鹽水共同加入一個(gè)大離心管中進(jìn)行3000 r/min的離心處理5分鐘，離心完之后將其上清液倒去，以上操作重復(fù)3至4次。操作完畢之后，用10μL量程的微量加樣槍吸取5μL的紅細(xì)胞加入495μL的生理鹽水中，充分混勻，就制成了1%的紅細(xì)胞懸浮液。

2.5 血凝和血凝抑制試驗(yàn)方法（HA是測(cè)抗原水平，HI測(cè)被檢樣品的抗體水平）

采用血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗(yàn)，利用血凝素（HA）蛋白的抗體與受體的特異性結(jié)合能夠干擾HA蛋白與紅細(xì)胞受體的結(jié)合從而出現(xiàn)抑制現(xiàn)象，用來(lái)檢測(cè)禽血清中的免疫抗體，在進(jìn)行HI試驗(yàn)之前必須進(jìn)行HA試驗(yàn)，以確定HI試驗(yàn)中所用抗原HA滴度[2]。

結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 以100%抑制凝集的血清最大稀釋孔以該血清的滴度，即血清效價(jià)（HI）。免疫后的HI效價(jià)≥5log2為陽(yáng)性，判定為免疫合格；HI效價(jià)<5log2為陰性，判定為不合格。免疫合格率在70%以上則可判定為免疫合格場(chǎng)。

2.5.1 血凝試驗(yàn)（HA）

在V型微量反應(yīng)板上每孔加入0.050mL生理鹽水，在第一孔中加入0.050mL病毒懸液，為準(zhǔn)備測(cè)定一個(gè)HA單位，在測(cè)試前作一系列的稀釋?zhuān)瑢⒉《疽?.050mL的體積做倍比稀釋。每孔再加入0.050mmL生理鹽水，每孔加入0.050mL1%的雞紅細(xì)胞。輕輕混勻，在室溫條件下（20℃）靜置40min，對(duì)照住紅細(xì)胞應(yīng)該明顯呈紐扣狀。判定血凝滴度:將板傾斜，觀察紅細(xì)胞有無(wú)蹭淚珠狀流淌，完全血凝的最高稀釋倍數(shù)代表一個(gè)血凝單位。

2.5.2 血凝抑制試驗(yàn)（HI）

微量反應(yīng)板每孔加入0.050mL生理鹽水。第1孔加入0.010mL樣品血清。將血清做0.010mL體積作倍比稀釋。倍比稀釋至最后1孔，吸出0.010mL液體棄去。棄去之后，每孔加入含有4個(gè)單位的病毒抗原0.050mL，再每孔加入0.050mL的1%的雞紅細(xì)胞（在加入過(guò)程中應(yīng)充分混勻，不間斷的輕微振蕩，防止血細(xì)胞凝結(jié)），混勻后放入水浴箱中靜置30mL，對(duì)照組紅細(xì)胞應(yīng)該呈現(xiàn)顯著地紐扣狀，能完全抑制4個(gè)單位抗原的血清最高稀釋度作為HI滴度。將板傾斜觀察，可更確切的判定結(jié)果。只有那些紅細(xì)胞同對(duì)照組孔幾乎以同樣比列淚流樣的方可判定為抑制陽(yáng)性。只有陰性對(duì)照血清滴度不大于1/4，陽(yáng)性對(duì)照組血清誤差不超過(guò)一個(gè)滴度，試驗(yàn)結(jié)果才有效。

3 結(jié)果

3.1 新城疫的抗體效價(jià)

表1 新城疫抗體效價(jià)分布情況

3.2 免疫合格率的判定

由表1可知新城疫抗體效價(jià)≥5log2為67%，這部分雞免疫合格；抗體效價(jià)≥6log2和≥7log2的分別達(dá)到63%和56%，這部分的雞獲得了較高的保護(hù)性；但是抗體水平≥5log2百分率低于70%，說(shuō)明此疫苗獲得的免疫效果不是很好，沒(méi)有達(dá)到預(yù)期的效果，不能有效的抵抗新城疫病毒，所以有新城疫病雞零星的出現(xiàn)。

4 根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果對(duì)該雞場(chǎng)新城疫防治的建議

4.1 由試驗(yàn)結(jié)果可知新城疫抗體效價(jià)≥5log2的僅為67.65%，未達(dá)到規(guī)定的70%，說(shuō)明結(jié)果免疫后，并沒(méi)有達(dá)到預(yù)期效果，在免疫上存在缺陷，需要進(jìn)行補(bǔ)免，否則一旦新城疫病毒入侵就有可能引發(fā)新城疫。

4.2 防制ND是一項(xiàng)十分艱巨和復(fù)雜的任務(wù)要采取嚴(yán)格的生物安全措施，防止NDV強(qiáng)毒進(jìn)入。如日常的隔離、衛(wèi)生、消毒制度[3]；防止一切帶毒動(dòng)物（特別是鳥(niǎo)類(lèi)、鼠類(lèi)和昆蟲(chóng)）和污染物進(jìn)入禽群；進(jìn)出的人員和車(chē)輛及用具消毒處理；飼料和飲水來(lái)源安全；不從疫區(qū)引進(jìn)種蛋和苗雞，新購(gòu)進(jìn)的雞隔離觀察2周以上證明健康者，方可合群；科學(xué)的畜牧制度，如全進(jìn)全出等；禽場(chǎng)的選址、生產(chǎn)的規(guī)模等均有利于防止病原體進(jìn)入[4]。

必須指出，很多禽場(chǎng)對(duì)以上措施認(rèn)識(shí)不足，而過(guò)分依賴(lài)疫苗接種。今年來(lái)的研究表明，只要NDV強(qiáng)毒侵入禽群，就能長(zhǎng)期傳播維持，不論采用何種免疫措施都不能將其從群內(nèi)清楚。在這個(gè)意義上，防止NDV強(qiáng)毒進(jìn)入禽群是頭等重要的防制措施[4]。

4.3 接種疫苗可以提高禽群的特異免疫力，減少NDV強(qiáng)毒的傳播，降低ND造成的損失。ND免疫計(jì)劃中疫苗的選擇和合理免疫程序的制定受母體抗原高低、強(qiáng)毒感染危險(xiǎn)大小、畜牧制度和其他感染存在多種因素影響，必須根據(jù)具體雞群而確立，不能一概而論。ND傳播迅速，死亡率很高，是嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的重要疾病之一，可造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。所以我們要做好雞群的抗體水平監(jiān)測(cè)工作，制訂科學(xué)的免疫程序，科學(xué)確定首免、二免、三免日齡。

5 結(jié)論

通過(guò)本次試驗(yàn)的結(jié)果表明該雞場(chǎng)為免疫不合格場(chǎng)，免疫合格率低于70%，必須經(jīng)過(guò)補(bǔ)免或再次免疫，以提高該雞場(chǎng)的免疫力，才能有效的防止新城疫病毒的入侵。該雞場(chǎng)在免疫上存在很多問(wèn)題，需要及時(shí)改正，嚴(yán)格按照科學(xué)的免疫程序，做好雞群的抗體水平監(jiān)測(cè)。

[1]鄭明球.家畜傳染病學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].3版.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2001，107-111.

[2]黃文忠.雞新城疫血凝抑制試驗(yàn)（HI）的影響因素[J].中國(guó)家禽，2000，22（5）:29.

[3]鄭世軍.雞病免疫防制技術(shù)[M].北京:北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1994，47-51.

[4]徐宜為.最新禽病與防制[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科技出版社，1993，44-45.