王洪江，李 卉，龐作良，陳 艷，姜孝芳，李惠武*

(1新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院，烏魯木齊 830011;2新疆醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院科研中心;3新疆醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院生物化學教研室)

基質(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs)屬于鋅膚酶超家族，能夠降解細胞外基質(zhì)，在腫瘤轉(zhuǎn)移中起正性調(diào)節(jié)作用。而 MMP組織抑制物(TIMP)為特異性抑制因子，能抑制 MMP的活性，在腫瘤轉(zhuǎn)移中起負性調(diào)節(jié)作用[1]。2009年 10月 ～2010年 10月，我們采用RT-PCR及 Western blot方法檢測 TIMP-1在哈薩克族食管癌組織中表達，并探討其在哈薩克族食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集同期手術(shù)切除的新鮮組織標本(包括癌組織及相距 6 cm以上的遠端無癌正常組織)48例 ，均為鱗癌，男 33例 、女 15例 ，年齡 37～67歲。臨床分期按照國際食管癌會議制定的標準分期，Ⅰ期 1例，Ⅱ期 17例，Ⅲ期 30例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 31例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 17例;高分化 38例，低分化 10例。術(shù)前均未做任何放療和化療，所有標本取出后做好標記，立即置入液氮中保存。

1.2 RT-PCR法檢測 總 RNA提取后，紫外分光光度計檢測 RNA純度(＞1.6)，計算出 RNA濃度;取 RNA產(chǎn)物 1μg進行逆轉(zhuǎn)錄，然后用逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行目的基因片段的 PCR擴增。GAPDH作為內(nèi)對照，取擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，紫外燈下觀察結(jié)果。用凝膠成像系統(tǒng)進行半定量分析，取目的基因條帶和 GAPDH條帶強度的比值作為目的基因的相對值。

1.3 組織蛋白提取及 Western blot檢測 任取 20例標本采用 Western blot法檢測 TIMP-1蛋白表達。取 0.01～0.04 g組織加入 10倍體積全細胞裂解液，置勻漿器上進行勻漿。勻漿液冰上裂解 30 min，12 000 r/min離心 5 min，收集上清，測定蛋白含量，-70℃分裝凍存。上樣總蛋白為 60μg，12%SDSPAGE電泳 3 h，轉(zhuǎn)膜，麗春紅 S染色，4℃封閉過夜;TBST洗膜 30 min，加入稀釋的一抗山羊抗人多克隆抗體 TIMP-1(1∶50)、兔抗人多克隆抗體 GAPDH(1∶400)，4℃孵育 8 h;TBST洗膜 30 min，與結(jié)合有辣根過氧化物酶標記的 IgG抗體(1∶5 000)室溫孵育 4 h，TBST洗膜 30 min;加入 ECM洗劑，暗室曝光、顯影、定影，對 X膠片掃描保存。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS13.0統(tǒng)計軟件包，均數(shù)比較采用 t檢驗，率的比較采用 χ2檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 TIMP-1 mRNA表達 TIMP-1 mRNA在 48例癌組織中表達陽性率為 100%(48/48)，高于正常組織 79.1%(38/48)。進行半定量分析其表達強度，癌組織 TIMP-1 mRNA為 0.76±0.37，正常組織為0.42±0.37，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見圖1、圖 2。

圖1 GAPDH(298 bp)2%瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 TIMP-1(680bp)2%瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 TIMP-1 mRNA表達與臨床病理特征的關(guān)系TIMP-1 mRNA表達量與臨床參數(shù)的關(guān)系見表1。顯示 TIMP-1 mRNA表達與各臨床參數(shù)無關(guān)(P均 ＞0.05)。在 18例臨床早期病例中，癌組織及其遠端無癌正常組織 TIMP-1 mRNA表達差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

表1 TIMP-1 mRNA表達與臨床病理特征的關(guān)系(OD值，±s)

表1 TIMP-1 mRNA表達與臨床病理特征的關(guān)系(OD值，±s)

分化程度高、中分化 38 0.74±0.35低分化 10 0.84±0.47 ＞0.05浸潤深度T1+T2 10 0.81±0.56 T3+T4 38 0.74±0.31 ＞0.05淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無18 0.69±0.28有30 0.80±0.31 ＞0.05

2.3 TIMP-1蛋白表達 Western blot檢測顯示，TIMP-1蛋白在 20例癌組織及其遠端無癌正常組織的表達與其 mRNA水平表達基本一致。見圖3。

圖3 TIMP-1和 GAPDH蛋白表達

3 討論

哈薩克族食管癌是新疆地區(qū)特高發(fā)疾病之一[2]，本課題組一直致力于其發(fā)病分子機制的研究。腫瘤細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移必須降解細胞外基質(zhì)，MMP是降解細胞外基質(zhì)的重要酶類，能降解細胞外基質(zhì)的許多成分，包括膠原、纖維連接蛋白、層粘連蛋白等，在機體的生理、病理過程中如胚胎發(fā)育、血管再生及腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移過程等發(fā)揮著重要作用。研究亦表明，MMPs的活性可被特異的 TIMPs所抑制[3]，MMPs與 TIMPs之間存在著表達量與活性程度的平衡狀態(tài)。作為其成員之一的 TIMP-1是一種分子量為 28×103kD的糖蛋白，它能與無活性的明膠酶 B形成可逆性復合物，從而較特異地抑制 MMPs活性。當 TIMP-1表達上調(diào)時，可抑制 MMPs的產(chǎn)生及活性發(fā)揮，使細胞外基質(zhì)降解明顯減少，具有抑制腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的能力[4]。本研究結(jié)果表明，在哈薩克族食管癌癌組織中 TIMP-1的表達高于其遠端正常組織。這一結(jié)果與董紹安等[5]研究結(jié)果一致，提示惡性腫瘤能促使 MMPs過度表達，使其與 TIMPs之間的平衡被打破，基膜被降解，癌細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移，而TIMP的反饋性過度表達則能阻止 MMPs對細胞外基質(zhì)的降解。本研究結(jié)果表明，在臨床早期病例中，TIMP-1的表達在癌組織及正常組織中存在差異，提示 TIMP-1在腫瘤發(fā)生的早期就可能開始發(fā)揮防止基質(zhì)降解、抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移等作用。此外，本研究中 TIMP-1 mRNA水平表達在腫瘤浸潤深度、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的差異無統(tǒng)計學意義，但亦有研究表明其表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[6]，這可能是由于所采用的研究方法不同所致。

綜上所述，本研究結(jié)果提示 TIMP-1高表達在腫瘤發(fā)生的早期可能起著阻礙腫瘤細胞浸潤和轉(zhuǎn)移作用，其具體的作用機制有待進一步研究。

[1]Tsuchiya Y，Sato H，Endo Y，et al.Tissue inhibitor of metalloproteinase 1 is a negative regulator of the metastatic ability of a human gastric cancer cell line，KKLS，in the chick embryo[J].Cancer Res，1993，53(6):1397-1402.

[2]侯浚，陳志峰，賀宇彤.食管癌的流行病學[J].河北職工醫(yī)學院學報，2000，17(4):27-29.

[3]Waas ET，Hendriks T，Lome R，et al.Plasma levels of matrix metalloproteinase-2 and tissue inhibitors of metalloproteinase-1 correlate with disease stage and survival in colorectal cancer patients[J].Dis Colon Rectum，2005，48(4):700-710.

[4]吳曉英，陳衛(wèi)昌，沈玉玲，等.MMP-1和 TIMP-1在人胃癌組織中的表達及臨床意義[J].江蘇醫(yī)藥，2008，34(12):1200-1202.

[5]董紹安，趙景嵐，林樂勝.食管鱗狀細胞癌組織 MMP-2、9與TIMP-1表達及意義[J].青島大學醫(yī)學院學報，2007，43(2):105-107.

[6]王曉蘭，李曉莉，陳奎生.MMP-9與 TIMP-1蛋白在食管鱗癌中的表達及其與腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移的關(guān)系[J].醫(yī)藥論壇雜志，2009，30(8):1-4.