郭艷，尚超，孫開來，鐘鳴，富偉能

（中國醫(yī)科大學(xué)1.口腔醫(yī)學(xué)院中心實驗室，沈陽 110002；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，沈陽 110001）

喉癌是原發(fā)于上皮的最常見的頭頸部惡性腫瘤，其中絕大多數(shù)組織類型是鱗狀細胞癌（laryngeal squamouscell carcinoma，LSCC）。盡管科研工作者從多個層面致力于喉鱗癌的研究，但其生存率和治療策略一直沒有顯著的提高。近年來，微小RNA（microRNAs，miRNAs）的發(fā)現(xiàn)為腫瘤治療靶點的研究帶來了新的曙光，它是一類長約22個核苷酸的非編碼小RNA，通過降解靶基因mRNA或抑制其翻譯而在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著類似于癌基因和抑癌基因的功能［1］。Li等［2］應(yīng)用 miRNAs芯片建立LSCCmiRNAs表達譜，發(fā)現(xiàn)微小RNA-24（microRNA-24，miR-24）表達水平顯著低于癌旁組織，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示miR-24在LSCC發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮著抑癌基因的功能。因此，本研究中我們將以LSCCHep2細胞系為研究對象，體外生物合成miR-24前體（pre-miR-24），通過轉(zhuǎn)染、MTT 和 Transwell小室法進一步探討miR-24對LSCC細胞增殖、侵襲能力的影響，以期為miR-24介導(dǎo)的LSCC分子機制研究乃至LSCC有效分子靶標的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

人LSCCHep2細胞系和鼠NIH3T3細胞系由本室保存，常規(guī)培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibco）中，取對數(shù)生長期的細胞用于后繼實驗。

1.2 miR-24前體合成與細胞轉(zhuǎn)染

miRNA-24前體（pre-miR-24）由 Ambion公司合成，cotrol miR為陰性對照。Hep2細胞于轉(zhuǎn)染前24 h接種于 24孔板中（4×104/孔），按照脂質(zhì)體 LipofectamineTM2000操作說明將50 nmol/L pre-miR-24和control miR分別轉(zhuǎn)入Hep2細胞中，單獨轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體組為空白對照。37℃5%CO2培養(yǎng)箱中重新培養(yǎng)后進行相關(guān)檢測。

1.3 熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染效果

用mirVana miRNA分離試劑盒（Ambion）提取總miRNA。QuantiMir反轉(zhuǎn)錄試劑盒（System Biosciences）逆轉(zhuǎn)錄成小RNA的cDNA。根據(jù)操作說明應(yīng)用SYBR熒光染料（Ambion）檢測pre-miR-24的表達，U6-snRNA為內(nèi)參。miR-24特異性上游引物為：5′-TGGCTCAGTTCAGCAGGAACAG-3′，通用下游引物為：5′-CGAATTCTAGAGCTCGAGGCAGGCGACATGGCTGGCTAGTTAAGCTTGGTACCGAGCT CGGATCCACTAGTCC（T）25VN-3′。反應(yīng)體系為 30 μL，反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min，然后按 95 ℃ 15 s，60℃1 min進行40個循環(huán)。應(yīng)用的儀器是ABI公司的7500熒光定量PCR儀，使用的軟件是7500 Software V2.0.5。3次獨立樣本經(jīng)過3次獨立實驗后得到的數(shù)據(jù)通過比較 CT 值法（2－ΔΔCT）進行相對定量分析。

1.4 相差顯微鏡下觀察細胞生長情況

Pre-miR-24轉(zhuǎn)染Hep2細胞36 h后，分別在相差顯微鏡下觀察各組細胞的生長情況并拍攝照片。

1.5 細胞增殖檢測

Hep2細胞轉(zhuǎn)染pre-miR-24及其對照control miR 1、3、5、7 d 后，細胞增殖檢測同參考文獻［3］。

1.6 體外細胞侵襲能力檢測

［3］。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

所有實驗重復(fù)3次，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行t檢驗，結(jié)果表示為x±s，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熒光定量PCR驗證轉(zhuǎn)染效果

為了確定pre-miR-24是否已經(jīng)成功導(dǎo)入Hep2細胞中，我們在轉(zhuǎn)染36 h后，用熒光定量PCR相對定量的方法檢測了miR-24的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染36 h時，pre-miR-24轉(zhuǎn)染組中miR-24的表達較對照組明顯升高（圖1A、1B），該結(jié)果表明瞬時轉(zhuǎn)染成功，后繼實驗可以采用pre-miR-24轉(zhuǎn)染36 h的細胞進行分析。

圖1 熒光定量PCR檢測miR-24表達結(jié)果。Fig.1 Result of miR-24 expression assayed by real-time quantitative PCR

2.2 miR-24抑制LSCCHep2細胞增殖

為了了解miR-24在LSCC Hep2細胞中的作用，我們在Hep2細胞中轉(zhuǎn)染pre-miR-24 36 h后，通過相差顯微鏡觀察pre-miR-24對Hep2細胞形態(tài)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pre-miR-24組Hep2細胞明顯變圓、細胞數(shù)量明顯減少（圖2A-2C），提示pre-miR-24能抑制Hep2細胞的生長；同樣MTT實驗表明，與轉(zhuǎn)染control組相比，pre-miR-24轉(zhuǎn)染組Hep2細胞增殖能力顯著降低（圖2D），進一步證實了miR-24具有抑制Hep2細胞增殖的能力。

2.3 miR-24降低LSCCHep2細胞體外侵襲能力

Hep2細胞轉(zhuǎn)染pre-miR-24 36h后，通過Transwell小室侵襲實驗觀察各組細胞侵襲能力的變化，結(jié)果顯示pre-miR-24轉(zhuǎn)染組的跨膜細胞數(shù)為（12.37±0.52），明顯低于control miR轉(zhuǎn)染組和空白對照組的跨膜細胞數(shù)［（32.48±0.95）；（34±1.25）］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），提示miR-24具有抑制Hep2細胞侵襲的作用。

圖2 miR-24對Hep2細胞增殖能力的影響Fig.2 Effects of miR-24 on Hep2 cell proliferation

3 討論

miRNAs是一種廣泛存在的對基因表達進行轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的分子，具有控制基因表達及細胞增殖、分化和凋亡等多種功能，幾乎在所有腫瘤的發(fā)生或發(fā)展過程中均可檢測到miRNAs的過表達或表達缺失，而且這些異常表達的miRNAs通常超過半數(shù)定位于癌基因或抑癌基因的相關(guān)遺傳區(qū)域，從而表現(xiàn)出類似癌基因或抑癌基因的作用［4，5］。研究表明，miR-24定位于染色體的EST區(qū)域，且該區(qū)域為染色體上的不穩(wěn)定區(qū)域，在頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）中經(jīng)常發(fā)生改變［6］。

關(guān)于miR-24異常表達與腫瘤生物學(xué)行為的關(guān)系目前仍然存在爭議。有的學(xué)者認為miR-24在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著類似于腫瘤抑制基因的功能，而有的學(xué)者認為miR-24發(fā)揮著癌基因的作用。如在宮頸癌Hela細胞中，miR-24表達下調(diào)，細胞增殖能力明顯增強；在肺癌A549細胞中，miR-24表達下調(diào)導(dǎo)致細胞生長水平的下調(diào)［7］。盡管2種觀點存在矛盾之處，但2者一致性認為miR-24在腫瘤中發(fā)揮重要的功能，并且目前尚沒有關(guān)于miR-24與LSCC發(fā)生、發(fā)展及生物學(xué)功能的研究。本研究發(fā)現(xiàn)，通過體外人為的上調(diào)miR-24的表達能明顯改變Hep2細胞形態(tài)，使細胞數(shù)量明顯減少，細胞的增殖和侵襲能力明顯降低，證實miR-24能夠減慢LSCC的發(fā)展速度，抑制LSCC的細胞增殖和侵襲能力。另外，由于miRNAs在血液中穩(wěn)定性很好，而且輕微的miRNAs表達降低即可在患者外周血中檢測到很高水平的miRNAs表達變化［8］，并且血液標本的采集損傷性小，進一步揭示血液中miR-24的表達變化亦可能成為臨床上極具價值的非侵入性LSCC診斷材料之一。

但為什么miR-24在不同組織類型中的表達不一樣，并且發(fā)揮的作用也不盡相同，甚至完全相反呢？我們推測這一現(xiàn)象的主要原因在于不同類型細胞中的miR-24調(diào)控的靶基因存在差異，導(dǎo)致參與的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路差異，進而對細胞生長、增殖等生物學(xué)活性產(chǎn)生不同的調(diào)控效應(yīng)。因此，在未來的研究中，我們將分析LSCC中miR-24的靶基因，進一步探討miR-24抑制細胞增殖和侵襲的分子機制。

參考文獻：

［1］Farazi TA，Spitzer JI，Morozov P，et al.miRNAsin human cancer［J］.JPathol，2011，223（2）：102-115.

［2］Li L，Zhang ZM，Liu Y，et al.DNA microarrays-based microRNA expression profiles derived from formalin-fixed paraffin-embedded tissue blocks of squammous cell carcinoma of larynx ［J］.Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi，2010，39（6）：391-395.

［3］郭艷，富偉能，尚超，等.HLA-B對喉癌Hep2細胞生物學(xué)行為的影響［J］.山東醫(yī)藥，2011，51（11）：21-22，33.

［4］Lal A，Navarro F，Maher CA，et al.miR-24 Inhibits cell proliferation by targeting E2F2，MYC，and other cell-cycle genes via binding to"seedless"3′UTRmicroRNA recognition elements［J］.Mol Cell，2009，35（5）：610-625.

［5］Sevignani C，Calin GA，Nnadi SC，et al.MicroRNA genes are frequently located near mouse cancer susceptibility loci ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104（19）：8017-8022.

［6］Yu YH，Kuo HK，Chang KW.Theevolvingtranscriptome of head and neck squamous cell carcinoma：a systematic review ［J］.PLoSOne，2008，3（9）：e3215.

［7］Cheng AM，Byrom MW，Shelton J，et al.Antisense inhibition of human miRNAs and indications for an involvement of miRNA in cell growth and apoptosis ［J］.Nucleic Acids Res，2005，33（4）：1290-1297.

［8］Lin SC，Liu CJ，Lin JA，et al.miR-24 up-regulation in oral carcinoma：positive association from clinical and in vitro analysis ［J］.Oral Oncol，2010，46（3）：204-208.