吳善斌，王學(xué)清，郭鴻飛，王孟春

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院消化內(nèi)科，沈陽 110004）

重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是一種常見的臨床急腹癥，常常并發(fā)胰腺組織細(xì)菌感染和與感染相關(guān)的全身炎性反應(yīng)綜合征和多器官功能障礙綜合征，其病情兇險(xiǎn)，病因復(fù)雜，預(yù)后不良，有報(bào)道死亡率高達(dá)20%~30%［1］。患者往往死于繼發(fā)感染和多臟器功能衰竭。

已有研究表明，多數(shù)的胰腺和胰周組織感染是由移位的腸道細(xì)菌及內(nèi)毒素所致的腸源性感染，腸道是引發(fā)感染細(xì)菌的主要來源［2］。SAP時(shí)腸屏障功能損傷，通透性增加，可能是導(dǎo)致腸道細(xì)菌及內(nèi)毒素發(fā)生移位的主要原因［3，4］。occludin蛋白是腸屏障的重要組成部分，目前已有occludin蛋白與暴發(fā)性肝功能衰竭相關(guān)腸屏障功能障礙、燒傷相關(guān)腸屏障損傷方面的研究［5，6］。本實(shí)驗(yàn)擬觀察小鼠SAP腸上皮損傷時(shí)occludin蛋白的表達(dá)情況，探討SAP時(shí)腸黏膜屏障功能改變。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及試劑

雄性昆明種小鼠40只，體質(zhì)量20~25 g，購自中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物部。兔抗小鼠occludin抗體（sc-5562，Santa Cruz公司），SP 免疫組化試劑盒、DAB試劑盒（北京中杉金橋公司），L-精氨酸（Sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 SAP小鼠模型制備：小鼠隨機(jī)分為對照組（n=8）和實(shí)驗(yàn)組（n=32）。所有小鼠在實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水。實(shí)驗(yàn)組小鼠分2次腹腔注射20%精氨酸（每次劑量2.5 g/kg），注射間隔為1 h。對照組腹腔注射等體積的無菌生理鹽水。

1.2.2 取材和固定：實(shí)驗(yàn)組小鼠在末次注射后3、6、12和24 h隨機(jī)各取8只予10%水合氯醛麻醉致死，迅速取出胰腺組織、回盲部3 cm回腸組織，胰腺組織放入10%中性甲醛溶液中固定，光鏡下HE染色觀察組織形態(tài)。部分腸組織放入2.5%戊二醛溶液中4℃固定，部分腸組織放入10%中性甲醛溶液固定。對照組小鼠在末次注射后立即予10%水合氯醛麻醉致死，同樣方法取出胰腺及腸組織。

1.2.3 胰腺病理學(xué)檢查：標(biāo)本固定于10%中性甲醛溶液，石蠟包埋、切片，進(jìn)行常規(guī)HE染色，光鏡觀察組織學(xué)變化。

1.2.4 電鏡觀察腸上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)：將小鼠處死后，立即取回腸，過程在2 min內(nèi)完成。將回腸用0.1 mol/L磷酸緩沖液洗凈，立即浸入2.5%戊二醛液中4℃固定2 h以上。0.1 mol磷酸緩沖液反復(fù)清洗3次，每次10~20 min。1%四氧化鋨固定液4℃固定2.5 h。0.1 mol/L磷酸緩沖液反復(fù)清洗3次，每次5 min。用50%、70%、80%、90%、100%梯度乙醇、丙酮脫水。用純環(huán)氧樹脂（Epon）812包埋液，在1∶1、1∶2、1∶3 的丙酮中分別浸泡 3、4、5 h。取出樣品，放置包埋模具中，放入60℃烤箱中聚合2 d。取出制成半薄切片（500 nm），甲基藍(lán)染色，光鏡下定位，制成超薄切片（50 nm），醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察。

1.2.5 免疫組織化學(xué)方法檢測腸組織中occludin蛋白的表達(dá)：采用免疫組織化學(xué)SP法，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，進(jìn)行蛋白表達(dá)的半定量分析。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組隨機(jī)抽取不同的切片8張，每張切片于光鏡下（×400）隨機(jī)選取5個(gè)視野，固定窗口面積，利用美國Universal Imaging Corporation圖像分析系統(tǒng)，應(yīng)用MetaMorph軟件分析平均光密度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)以x±s表示，應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間比較采用LSD方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胰腺大體及組織學(xué)改變

對照組胰腺大體未見明顯異常；實(shí)驗(yàn)組3 h無明顯變化，6 h可見胰腺輕度充血，12 h可見微量腹水，24 h時(shí)腹腔可見較多腹水，并見胰腺體積增大、水腫明顯，腸道部分充血、擴(kuò)張（圖1）。對照組小鼠的胰腺組織結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞形態(tài)正常，無出血壞死；實(shí)驗(yàn)組3 h無明顯變化，6 h呈現(xiàn)水腫、胰腺炎改變，小葉間隙增寬、炎細(xì)胞侵潤，但小葉結(jié)構(gòu)完好，腺泡細(xì)胞無壞死，12和24 h胰腺小葉結(jié)構(gòu)紊亂，明顯充血，腺泡細(xì)胞壞死，壞死區(qū)周圍炎細(xì)胞侵潤（圖2）。

圖1 小鼠胰腺大體形態(tài)變化Fig.1 G ross changes in mouse pancreas

圖2 胰腺病理學(xué)變化 ×400Fig.2 Pathological changes in mouse pancreas×400

2.2 電鏡下腸上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變

對照組腸黏膜上皮細(xì)胞表面微絨毛排列整齊，柱狀上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器豐富，結(jié)構(gòu)未見異常，細(xì)胞間連接緊密；實(shí)驗(yàn)組3 h無明顯變化，其余各時(shí)間點(diǎn)可見微絨毛稀疏、排列不整，部分?jǐn)嗔?、脫落，線粒體腫脹，嵴減少，胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體擴(kuò)張呈空泡變性，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，核糖體脫落，胞核形狀不規(guī)則，核內(nèi)異染色質(zhì)濃縮且邊集明顯，細(xì)胞連接增寬，24 h時(shí)改變最明顯（圖3）。

圖3 電鏡下腸上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變 ×8 000Fig.3 U ltrastructural changes in intestinal epithelial cells observed under electron microscope×8 000

2.3 腸組織中occludin蛋白的表達(dá)

對照組occludin蛋白均勻一致地分布于腸上皮細(xì)胞連接處的頂端，呈表達(dá)很強(qiáng)的棕褐色信號；實(shí)驗(yàn)組occludin蛋白表達(dá)顏色變淡，分布不均，表達(dá)逐漸減弱（圖4）。對照組與實(shí)驗(yàn)組3、6、12和 24 h occludin蛋白表達(dá)的平均光密度值分別為0.344 8±0.002 8，0.343 1±0.002 0，0.342 3±0.001 9，0.339 4±0.001 5，0.309 5±0.002 7，實(shí)驗(yàn)組與對照組比較，3 h時(shí)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），6、12和24 h時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。

圖4 occludin蛋白在腸組織的表達(dá) ×400Fig.4 Expression of occludin protein in intestinal tissues×400

3 討論

研究表明SAP時(shí)多數(shù)的胰腺和胰周組織感染是由移位的腸道細(xì)菌及內(nèi)毒素所致的腸源性感染，腸道是引發(fā)感染細(xì)菌的主要來源，而腸屏障功能的損傷，可能是導(dǎo)致腸道細(xì)菌移位的主要原因。大分子物質(zhì)包括細(xì)菌穿過腸黏膜上皮細(xì)胞，一是通過上皮細(xì)胞的胞飲作用，另一種是通過細(xì)胞旁間隙［7］，后者依賴于細(xì)胞間連接完整性的破壞。腸上皮細(xì)胞間連接由緊密連接、黏附連接、縫隙連接等構(gòu)成。構(gòu)成腸上皮細(xì)胞間連接的蛋白主要有occludin、claudin、ZO-1 等［8］。occludin 蛋白是緊密連接中重要的結(jié)構(gòu)蛋白，能通過外環(huán)以拉鏈?zhǔn)浇Y(jié)合進(jìn)而產(chǎn)生嚴(yán)密的細(xì)胞間連接［9］。有研究表明，缺乏occludin蛋白的成纖維細(xì)胞不能形成典型的緊密連接結(jié)構(gòu)［10］，occludin蛋白作為構(gòu)成緊密連接的主要蛋白之一，在維持緊密連接結(jié)構(gòu)方面具有重要作用。目前對燒傷和暴發(fā)肝功能衰竭動物模型的研究顯示有腸屏障損傷，occludin 蛋白的表達(dá)降低［5，6］，但有關(guān)SAP時(shí)腸上皮occludin蛋白表達(dá)情況的研究較少。

本研究顯示，電鏡下觀察SAP小鼠腸上皮超微結(jié)構(gòu)，微絨毛稀疏、排列不整，部分?jǐn)嗔?、脫落，?xì)胞連接增寬，24 h時(shí)改變最明顯，表明SAP可導(dǎo)致小鼠腸黏膜屏障損傷。免疫組化顯示，對照組occludin蛋白均勻一致地分布于腸上皮細(xì)胞連接處的頂端，呈表達(dá)很強(qiáng)的棕褐色信號。而實(shí)驗(yàn)組3、6、12、24 h時(shí)occludin蛋白表達(dá)逐漸減弱，顏色變淡，分布不均。免疫組化平均光密度值示實(shí)驗(yàn)組與對照組比較3 h時(shí)差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，6、12、24 h時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在SAP小鼠模型中，腸上皮occludin蛋白表達(dá)降低，24 h時(shí)最明顯，與腸上皮超微結(jié)構(gòu)改變一致，因而推測腸上皮occludin蛋白表達(dá)下調(diào)可能導(dǎo)致緊密連接的完整性受到破壞，導(dǎo)致細(xì)胞間隙增寬，進(jìn)而為細(xì)菌的穿透提供了可能，引起胰腺和胰周組織感染。SAP時(shí)occludin蛋白表達(dá)降低可能主要與下列因素有關(guān)：（1）炎性介質(zhì)及細(xì)胞因子的釋放，研究已發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子α、γ干擾素等炎性因子有協(xié)同作用，下調(diào) occludin 蛋白啟動子的表達(dá)［11］；（2）腸道微循環(huán)障礙，已有研究發(fā)現(xiàn)，停循環(huán)低溫后家兔腦血管內(nèi)皮細(xì)胞 occludin 表達(dá)減少［12］；（3）腸道營養(yǎng)障礙，胰腺炎由于禁食及高代謝，導(dǎo)致合成occludin蛋白的營養(yǎng)物質(zhì)缺乏。但SAP時(shí)occuldin蛋白表達(dá)降低的確切機(jī)制有待于進(jìn)一步相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。

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