朱中佳， 熊富良， 張雪瓊， 馮井慶， 高文天

(武漢理工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，湖北武漢 430070)

甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch、脹果甘草Glycyrrhiza inflataBat或光果甘草Glycyrrhiza glabraL.的干燥根及根莖，具有補(bǔ)脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調(diào)和諸藥的功能［1］。甘草的主要成分為甘草酸等三萜皂苷和甘草苷為主的甘草黃酮。甘草中三萜類皂苷具有含量高、生理活性強(qiáng)的特點(diǎn)，不僅具有抗?jié)儭⑾?、解毒等生理活性，近年研究還發(fā)現(xiàn)具有抗病毒、抗癌活性［2］。而日本采用甘草總皂苷治療慢性乙肝已有20多年的歷史［3］。因此探討甘草的提取和純化工藝具有十分重要的意義。甘草中有效成分的提取方法包括水提取法［4］、索氏提取法［5］、超高壓法［6］、微波輔助提取法［7］、超聲波提取法［8］和超臨界 CO2萃取法［9］等。而正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)在優(yōu)化甘草提取工藝中應(yīng)用廣泛［10－11］。甘草中有效成分的純化方法則主要為大孔吸附樹脂法［12－13］。本試驗(yàn)采用水提取法提取甘草總皂苷并采用正交試驗(yàn)法對(duì)其工藝進(jìn)行了優(yōu)選，接著以HPD系列的大孔樹脂純化了甘草總皂苷。

1 儀器與材料

Agilent 1100型高效液相色譜儀;UV1101型紫外分光光度儀，JA2003N型分析天平，AS5150A型超聲波清洗器，DHG－9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱。

HPD－100、HPD－300、HPD－700、HPD－722 和 D－101 型大孔吸附樹脂由河北滄州寶恩化工有限公司提供。甘草酸單銨鹽對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)，甘草購(gòu)自武漢市神草中藥飲片有限責(zé)任公司，由武漢理工大學(xué)化工學(xué)院劉小平教授鑒定。所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 分析方法

2.1.1 甘草中甘草酸含量測(cè)定方法(HPLC)

色譜條件:Kromasil C18(4.6 mm ×250 mm;5 μm);檢測(cè)波長(zhǎng):250 nm;流速:1 mL/min;柱溫:25℃;流動(dòng)相為甲醇－0.2 mol/L醋酸銨溶液－冰醋酸(67∶33∶1)。

對(duì)照品溶液的制備:取甘草酸單銨鹽對(duì)照品10 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得(每1 mL含甘草酸單銨鹽對(duì)照品0.2 mg，折合甘草酸為0.195 9 mg)。

供試品溶液的制備:精密吸取0.1 g生藥/mL的甘草提取液1 mL，加水稀釋并定容至50 mL，搖勻，濾過，即得。

線性關(guān)系考察:精密吸取上述對(duì)照品溶液 1，2，4，6，8 mL，置10 mL量瓶中加流動(dòng)相稀釋至刻度。按上述的色譜條件，分別進(jìn)樣20 μL，測(cè)定其峰面積，并以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程:Y=15 974X+100.4，r2=0.999 7。結(jié)果表明，甘草酸在0.019 6～0.156 8 mg/mL的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.1.2 甘草總皂苷含量測(cè)定方法(UV)

對(duì)照品溶液的制備:精密稱取甘草酸單銨鹽對(duì)照品10.1 mg，置25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL用甲醇稀釋至10 mL，即得。

供試品溶液的制備:精密吸取樣品溶液1 mL，加甲醇稀釋并定容至50 mL，搖勻，濾過，即得。

最大吸收波長(zhǎng)的確定:取對(duì)照品溶液，在紫外分光光度計(jì)上200～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果表明在258 nm處有最大吸收，故選用258 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

線性關(guān)系考察:精密量取對(duì)照品溶液(40.4 μg/mL)1，2，4，6，8 mL，置 10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，258 nm 測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程:Y=0.026 3X+0.013，r2=0.999 6，線性范圍:4.04 ～32.32 μg/mL。

2.2 甘草總皂苷的提取工藝

通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定水為提取溶劑后，為優(yōu)化水煎煮的條件，選用正交試驗(yàn)法，選定加水量、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)作為考察的3個(gè)因素，每個(gè)因素各取3個(gè)水平(見表1)。采用L9(34)正交進(jìn)行試驗(yàn)，以甘草酸和甘草總皂苷的提取率為考察指標(biāo)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析，確定最佳提取工藝，見表2～4。

表1 因素水平表

表2 正交試驗(yàn)

表3 方差分析(甘草酸)

表4 方差分析(總皂苷)

由正交試驗(yàn)結(jié)果確定最佳提取工藝:加水量8倍，煎煮時(shí)間2 h，煎煮次數(shù)3次。按該提取工藝進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果甘草酸平均提取率為2.05%(RSD ＜2%)，甘草總皂苷平均提取率為4.2%(RSD ＜2%)。以最佳提取工藝提取，提取液加水定容到含生藥0.2 g/mL的溶液(甘草總皂苷含量為8.39 mg/mL)，作為下一步實(shí)驗(yàn)上樣液。

甘草酸提取率=所測(cè)甘草酸量(g)/所用甘草量(g)×100%

甘草總皂苷提取率=所測(cè)總皂苷量(g)/所用甘草量(g)×100%

2.3 大孔樹脂純化工藝

2.3.1 樹脂型號(hào)篩選:精密稱取上述5種大孔樹脂(均相當(dāng)于干樹脂1 g)，分裝入50 mL具塞錐形瓶中，精密加入上樣液50 mL(相當(dāng)于0.2 g生藥/mL)，每30 min振搖1次，持續(xù)3 h后，靜置24 h，上樣液濾過，按2.1項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度后，計(jì)算吸附量。濾出的各樹脂另置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，每30 min振搖1次，持續(xù)3 h，靜置24 h后濾過，測(cè)定吸光度，計(jì)算解吸率，結(jié)果見表5。綜合分析，HPD－300樹脂為甘草總皂苷純化的最佳樹脂。另取3份HPD－300樹脂(均相當(dāng)于干樹脂1 g)，按上述方法進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果平均比吸附量170.14 mg/g(RSD＜2%)，平均解吸率87.65%(RSD＜2%)，故選取 HPD－300樹脂為甘草總皂苷純化所用樹脂。

表5 大孔樹脂對(duì)甘草總皂苷的吸附及解吸的影響

比吸附量=(上樣液中總皂苷的質(zhì)量濃度×體積－吸附后溶液中總皂苷的質(zhì)量濃度×體積)/干樹脂質(zhì)量

比洗脫量=洗脫液中總皂苷的質(zhì)量/干樹脂質(zhì)量

解吸率=(洗脫液質(zhì)量濃度×體積)/飽和吸附量×100%

2.3.2 上樣液質(zhì)量濃度的確定:準(zhǔn)確稱取處理好的HPD－300型樹脂3份(均相當(dāng)于干樹脂4 g)，濕法裝柱。取上樣液(生藥0.2 g/mL)50 mL，分別加水稀釋0、1、2倍，制備成質(zhì)量濃度分別為0.2 g/mL、0.1 g/mL、0.05 g/mL的上樣液，每個(gè)質(zhì)量濃度上樣液平行上柱，以2 mL/min的流速吸附完全后，先以4 BV水沖洗，再換用4 BV 70%乙醇洗脫，收集洗脫液，得液體樣品。按2.1項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度后，計(jì)算洗脫液中總皂苷比洗脫量，結(jié)果分別為75.6 mg/g、69.4 mg/g、67.5 mg/g?？梢?，在上柱液中總皂苷質(zhì)量固定的情況下，上柱液質(zhì)量濃度為0.2 g生藥/mL時(shí)洗脫效果最好。

2.3.3 最大上樣量的確定:準(zhǔn)確稱取處理好的HPD－300樹脂裝柱(相當(dāng)于干樹脂4 g)，精密吸取上樣液200 mL，以流速2 mL/min通過樹脂柱，每1BV接收一次流出液，并測(cè)定每份流出液中的總皂苷質(zhì)量濃度，以流份份數(shù)與流出液中總皂苷質(zhì)量濃度做圖，結(jié)果見圖1?？梢娫谏蠘右旱馁|(zhì)量濃度為0.2 g生藥/mL時(shí)，在第5個(gè)流份開始泄漏，因此確定最大上樣量為5BV。

2.3.4 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)的確定:精密吸取上樣液100 mL，以2 mL/min的流速連續(xù)通過HPD300樹脂柱，先用4 BV水沖洗，再依次用10%、30%、50%、70%、90%乙醇洗脫，洗脫劑用量均為3 BV，每1 BV接收一次流出液，測(cè)定各段流出液中的總皂苷的質(zhì)量濃度，結(jié)果見圖2?？梢姼什菘傇碥罩饕性?0%～70%乙醇洗脫部分。

圖1 HPD300樹脂吸附總皂苷的動(dòng)態(tài)吸附曲線

圖2 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)動(dòng)態(tài)洗脫性能的影晌

2.3.5 洗脫劑用量的確定:為進(jìn)一步確定乙醇體積分?jǐn)?shù)并考察洗脫劑用量，取100 mL上樣液分別上柱，均用水洗脫4 BV后，分別用50%和70%乙醇洗脫，控制流速2 mL/min，直至流出液無色，每1 BV接收一次流出液，測(cè)定各段流出液中的總皂苷的質(zhì)量濃度，結(jié)果見圖3?？梢?0%乙醇洗脫效果好于70%乙醇，且在第6份洗脫液中總皂苷已經(jīng)很少，可認(rèn)為樹脂柱上吸附的總皂苷已經(jīng)洗脫完全，故確定洗脫劑為50%乙醇，用量為6 BV。

圖3 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇的洗脫曲線

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用正交試驗(yàn)確定了甘草總皂苷的水煎煮提取條件為加水量8倍，煎煮時(shí)間2 h，煎煮次數(shù)3次。在這種條件下，甘草總皂苷提取率能達(dá)到4.2%。

實(shí)驗(yàn)表明HPD300型大孔吸附樹脂對(duì)甘草總皂苷具有良好的吸附性能，具有較大的吸附量，且易吸附、易解吸。其工藝條件為上樣液質(zhì)量濃度為0.2 g生藥/mL，上樣量5 BV;50%乙醇洗脫6 BV。

實(shí)驗(yàn)中確定的總皂苷提取純化工藝可為進(jìn)一步提取純化甘草總皂苷提供借鑒，從而為進(jìn)一步開發(fā)甘草有效部位新藥提供參考。

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