趙 爽， 嚴(yán)銘銘， 趙大慶， 黃耀玲， 唐 燦

(長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林長春 130117)

小飛蓬Erigeron canadensisL.為菊科植物小飛蓬Erigeron canadensisL.的干燥全草［1］。有文獻(xiàn)記載小飛蓬的藥用有清熱利濕、散瘀消腫、改善腎的微循環(huán)的功效［2］并且還具有較強(qiáng)抗腫瘤的藥理作用［2］。本課題組已從該中藥材中分離出近二十余種黃酮類化合物，主要為:蘆丁、槲皮素、木犀草素、芹菜素、5，7，4′－三羥基－3′－甲氧基黃酮、圣草酚、4′－羥基黃芩素－7－O－β－D－吡喃葡萄糖苷、4′－羥基黃芩素－7－O－β－D－吡喃葡萄糖醛酸苷等黃酮類化合物［3］。在進(jìn)一步對小飛蓬總黃酮提取物進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，小飛蓬黃酮類化合物除了具有文獻(xiàn)報(bào)道的藥理作用以外，還具有較強(qiáng)的抗氧化活性，在抗老化，抗突變，調(diào)血脂等方面具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。

本試驗(yàn)以優(yōu)選小飛蓬總黃酮最佳乙醇提取工藝為目標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)法，以總黃酮和槲皮素的含量為指標(biāo)對乙醇提取工藝進(jìn)行比較，確立了最佳提取工藝，并對其體外自由基的清除作用進(jìn)行了初步研究，為小飛蓬的利用和綜合開發(fā)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

UV－1700型分光光度計(jì)(日本島津公司);Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國Agilent公司);METTLER－AE240型電子分析天平(瑞士METTLER公司);BUCHI旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司)。

蘆丁對照品(中國藥品生物制品檢定所，編號(hào):111520－200201)、槲皮素對照品 (中國藥品生物制品檢定所，編號(hào)0721－200010)，二者純度都達(dá)到98%以上，供含量測定用。1，1 二苯基苦味苯肼(1.1－dipbenyl－2－picrylhydrazyl，DPPH)、維生素C(Vit C)對照品、維生素E(Vit E)對照品均購于sigma公司;大孔吸附樹脂(天津南開大學(xué)化工廠);色譜級甲醇購于美國Fisher公司，其余試劑均為分析純，均購于(北京精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司)。

小飛蓬采于吉林省長白縣，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)姜大成教授鑒定為菊科飛蓬屬植物小飛蓬Erigeron canadensisL.。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 總黃酮含量測定方法［4］

2.1.1 對照品溶液的制備:精密稱取5.38 mg蘆丁對照品于25 mL量瓶，70%乙醇溶解并定容，配制成濃度為0.209 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:分別精密吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3 mL蘆丁對照品溶液于10 mL量瓶中，加70%乙醇至5 mL，依次加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，再加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，之后加入4%氫氧化鈉溶液4 mL，最后用70%乙醇稀釋定容，搖勻，放置15 min，進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果均在510 nm處有最大吸收峰。在510 nm處測定不同濃度下的吸光度值作標(biāo)準(zhǔn)曲線。得蘆丁濃度Y與吸光度A關(guān)系曲線回歸方程式:Y=11.604X－0.011 3，相關(guān)系數(shù):r=0.999 5，表明蘆丁在0.010 8～0.064 6 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線形關(guān)系。

2.1.3 樣品溶液的制備:分別稱取小飛蓬粗粉500 g按表4正交實(shí)驗(yàn)表中的條件進(jìn)行乙醇回流提取，合并濾液，過濾，濾液蒸干，即得小飛蓬總黃酮提取物。精密稱取上述按正交表制備的相應(yīng)總黃酮提取物50 mg，置100 mL量瓶中，加70%乙醇適量使溶解，定容至刻度，搖勻。精密吸取上述溶液1 mL于10 mL量瓶中，加70%乙醇定容至5 mL，照2.1.2項(xiàng)下自加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL起，在510 nm下測定其吸光度，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其總黃酮濃度。

2.2 槲皮素含量測定方法［5］

2.2.1 色譜條件:色譜柱:Agilent Zorbax SB－C18(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇 －0.5%磷酸(47 ∶53)，流速:1.0 mL/min;檢測波長為360 nm;柱溫:30℃;理論塔板數(shù)按槲皮素計(jì)應(yīng)不低于4 000。

2.2.2 對照品溶液的制備:精密稱取槲皮素對照品溶液6.5 mg置100 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解，定容至刻度，搖勻，即得濃度為0.065 mg/mL的槲皮素對照品溶液。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:精密吸取上述對照品溶液8.0，10.0，12.0，14.0，16.0，18.0 μL 注入高效液相色譜儀中。按照上述色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，對照品的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得槲皮素的標(biāo)準(zhǔn)曲線為:Y=1 081X+16.062，r=0.999 9。表明槲皮素進(jìn)樣量在0.52～1.17 μg范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.4 樣品溶液的制備:稱取上述按正交表制備的相應(yīng)總黃酮提取物5 g，加乙酸乙酯回流提取3次，每次500 mL，合并3次乙酸乙酯提取液，減壓蒸餾回收，提取物蒸干，加甲醇30 mL溶解，拌樣于5 g聚酰胺(100～200目)，收集95%乙醇洗脫液，60℃水浴蒸干，加甲醇10 mL，超聲，過濾，濾液蒸干，加甲醇溶解，轉(zhuǎn)至10 mL量瓶中，甲醇定容，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。分別精密稱取對照品溶液與樣品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定槲皮素含量。

2.3 DPPH溶液的配制及測定方法

在裝有2 mL濃度為132.0 μg/mL的DPPH70%乙醇溶液的比色管中，加入不同濃度的樣品溶液2 mL搖勻，避光靜置30 min，在517 nm處測定吸光度Ai。用70%乙醇溶液代替樣品溶液，得吸光度A0。70%乙醇代替DPPH，得吸光度Aj詳見文獻(xiàn)［6］。

清除率=1－［(Ai－Aj)/A0］×100%

式中，A0為2 mL DPPH70%乙醇溶液和2 mL70%乙醇溶液的吸光度;Ai為2 mL的DPPH70%乙醇溶液和2 mL樣品的吸光度;Aj為2 mL70%乙醇溶液和2 mL樣品的吸光度。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素對提取率的影響研究

3.1.1 提取次數(shù)的影響 分別稱取小飛蓬500 g，設(shè)定提取4次，每次提取1.0 h，料液比1∶10，70%乙醇加熱回流提取。計(jì)算每次提取總黃酮含量在4次總黃酮含量總和中所占的比例。結(jié)果見表1。

從表1中可以看出第1次提取總黃酮含量占總含量53%，達(dá)到了總體含量一半以上，第2次提取總黃酮含量達(dá)到42%占總黃酮含量很高的比例，第3次提取和第4次提取總黃酮含量只達(dá)到4%和1%占總黃酮總量很小比例，為了考慮節(jié)約成本，提高效率，則取消第3次和第4次提取次數(shù)。

表1 提取次數(shù)對總黃酮含量的影響(n=2)

3.1.2 提取時(shí)間的影響 提取時(shí)間過短，有效成分提取不完全，提取時(shí)間過長，費(fèi)時(shí)且成本較高。根據(jù)實(shí)驗(yàn)預(yù)試并參照文獻(xiàn)報(bào)道，提取時(shí)間選擇1.0 h、1.5 h、2.0 h提取效果較好。

3.1.3 料液比的影響 加醇量太少，不能完全浸沒藥材，有效成分提取不完全，加醇量太大，成本較高。根據(jù)預(yù)試結(jié)果，加醇量為8倍、10倍、12倍較為合理。

3.1.4 醇濃度的影響 由于小飛蓬除了含有脂溶性成分外，且含有水溶性成分，為了將有效成分提取完全，以蘆丁含量為指標(biāo)，選取乙醇濃度為50%、60%、70%、80%、90%，對醇提濃度進(jìn)行了優(yōu)選預(yù)示試驗(yàn)，結(jié)果見表2，從表2中可以看出，當(dāng)乙醇濃為70%時(shí)小飛蓬總黃酮的含量較高，故得出醇提濃度最佳范圍為65%～75%。

表2 乙醇濃度對總黃酮提取率的影響(n=2)

3.2 小飛蓬有效部位提取工藝的優(yōu)化

單因素實(shí)驗(yàn)說明，提取次數(shù)為2次時(shí)，提取的小飛蓬總黃酮的量已達(dá)到其總量的95%以上，為適合工業(yè)化生產(chǎn)，節(jié)省能源，選取提取次數(shù)為2次，在此基礎(chǔ)上，對乙醇濃度、提取時(shí)間及料液比進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)選，采用L9(34)正交試驗(yàn)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，因素水平見表3，正交試驗(yàn)結(jié)果見表4、表5。

表3 因素水平表

以小飛蓬總黃酮含量為考察指標(biāo)時(shí)，方差分析表明:因素C和因素A對總黃酮的影響最大，因素B對結(jié)果有影響，直觀分析表明:最佳提取工藝為A2B1C2;以槲皮素含量為考察指標(biāo)時(shí)，方差分析表明:因素B對槲皮素提取的影響最大，因素A對其有影響，而因素C對結(jié)果無影響，直觀分析表明:最佳提取工藝為A2B1C3。綜合上述兩個(gè)考察指標(biāo)的方差及直觀分析，可以看出因素A與B優(yōu)選的結(jié)果一致，因素C對總黃酮提取影響較大，而對槲皮素提取無影響，為有效地將總黃酮提取出來，制定A2B1C2作為最佳提取方案，即70%乙醇、料液比1∶10、每次1.0 h。

3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

稱取小飛蓬藥材3批，按正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選結(jié)果進(jìn)行提取并測定其含量。結(jié)果見表6。

3.4 體外抗氧化實(shí)驗(yàn)

DPPH自由基清除 DPPH自由基是判定藥物體外抗氧化活性的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法，并利用維生素E能抑制脂溶性抗氧化物和維生素C能抑制水溶性抗氧化物的特點(diǎn)綜合評定小飛蓬總黃酮的抗氧化活性。以正交優(yōu)選工藝制備的小飛蓬總黃酮樣品A及在此優(yōu)選工藝上進(jìn)一步純化的小飛蓬總黃酮精制品B及精制品C進(jìn)行了自由基的清除能力實(shí)驗(yàn)，并與相應(yīng)濃度的維生素C和維生素E作為對照，結(jié)果見表7。

表4正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果(n=2)

表5正交實(shí)驗(yàn)方差分析

表6 正交工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

表7 各供試品IC50值(n=2)

由表7可知，不同總黃酮含量的樣品清除DPPH自由基的能力存在顯著性差異，其中優(yōu)選工藝樣品A逐步純化得到樣品B活性強(qiáng)于維生素E而弱于維生素C，最終純化樣品C的活性高于維生素E及維生素C。證明樣品A和B對脂溶性自由基有很強(qiáng)的抗氧化活性，樣品C由于進(jìn)一步進(jìn)行純化，隨著含量的不斷提高不但對脂溶性自由基抗氧化活性逐步增強(qiáng)并且對水溶性自由基抗氧化活性也明顯增強(qiáng)。

4 結(jié)論

4.1 本實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交實(shí)驗(yàn)法對小飛蓬中總黃酮有效部位的乙醇提取工藝進(jìn)行了優(yōu)選，選用L9(34)正交進(jìn)行考察，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明小飛蓬有效部位最佳提取工藝條件是，以70%乙醇為提取溶劑，在1∶10料液比條件下提取2次每次1.0 h。該提取工藝簡單，條件易于控制，提取率高。

4.2 抗氧化實(shí)驗(yàn)表明，黃酮類成分清除DPPH自由基的能力與化合物中酚羥基的取代個(gè)數(shù)和位置有關(guān);中藥清除DPPH自由基能力與總黃酮類成分含量之間存在相關(guān)性。小飛蓬中的黃酮類化合物有良好的DPPH清除活性，且隨著小飛蓬中總黃酮含量的提高，IC50值也明顯提高，即隨著小飛蓬中總黃酮含量的提高，其抗氧化活性明顯增強(qiáng)。

［1］林 容，陳藝林.中國植物志，菊科(一)［M］.第74卷.北京:科學(xué)出版社，1985:295.

［2］劉大奎.燈盞花素治療糖尿病腎病高粘血癥療效觀察［J］.湖北中醫(yī)雜志，2003，25(5):13－14.

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