王 冰， 張振秋， 孫艷濤， 李 力， 鄧雪男（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連 116600）

升麻及其炮制品的HPLC指紋圖譜研究

王 冰， 張振秋*， 孫艷濤， 李 力， 鄧雪男（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連 116600）

目的 RP-HPLC法建立升麻指紋圖譜。方法 采用Phenomsil BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）梯度洗脫，0～5 min（88%A ∶12%B），25 min（80%A ∶20%B），45 min（70%A ∶30%B），60min（60%A∶40%B），檢測波長316 nm，柱溫40℃；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。結(jié)果 建立了升麻的HPLC指紋圖譜，標(biāo)定出15個(gè)共有指紋峰。結(jié)論 升麻藥材的指紋圖譜可用于升麻的定性鑒別，為升麻藥材的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

升麻；指紋圖譜

升麻為毛茛科植物大三葉升麻Cimicifuga heracleifoliaKom.、興 安 升 麻Cimicifugadahurica（Turcz.）Maxim.或升麻Cimicifuga foetidaL.的干燥莖。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品。其味辛、微甘，性微寒。歸肺、脾、胃、大腸經(jīng)。具有發(fā)表透疹、清熱解毒、升舉陽氣的功效。用于風(fēng)熱頭痛，齒痛，口瘡，咽喉腫痛，麻疹不透，陽毒發(fā)斑；脫肛，子宮脫垂［1］。升麻中含有有機(jī)酸、糖苷、色原酮、揮發(fā)油、甾醇等多種類型的化學(xué)成分［2］。當(dāng)前對中藥指紋圖譜的研究較多［3-4］，主要有 GC［5-6］和 HPLC 法［7-8］。對升麻的研究主要集中于定量測定［9］和成分分析［10］方面。本實(shí)驗(yàn)采用RP-HPLC法建立并分析升麻的指紋圖譜［11］，為升麻藥材及其炮制品的質(zhì)量評價(jià)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent1100高效液相色譜儀（儀器編號：20041191 DE43607375），配置四元梯度泵，在線脫氣機(jī)，VWD檢測器；Phenomsil BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；METTLER AB135-S 十萬分之一電子分析天平（瑞士）；AR2140電子分析天平（上海奧豪斯公司）。

1.2 試藥 異阿魏酸（中國藥品生物制品檢定所，批號111698-200602）。升麻藥材經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)李峰教授鑒定均為正品藥材。樣品編號依次為1～10；升麻炒炭品由北京商品地生品依藥典方法自制，樣品編號為11；蜜炙品購自上海，樣品編號為12；來源、種類和收集時(shí)間見表1；水為重蒸餾水，甲醇、乙腈（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，色譜純），磷酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，分析純）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Phenomsil BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動相：乙腈（A）-0.1% 磷酸水溶液（B）（13∶87）；流動相梯度：0～5 min（88%A∶12%B），25 min（80%A ∶20%B），45 min（70%A∶30%B），60 min（60%A ∶40%B），檢測波長為 316 nm；柱溫：40 ℃；體積流量：1.0 mL/min。

2.2 參照物溶液的制備 取異阿魏酸對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加10%乙醇制成每1 mL含異阿魏酸202.8 μg的溶液，即得。

表1 不同商品地升麻藥材Tab.1 Cimicifuga from different resources

2.3 供試品溶液的制備 分別稱取1～12號藥材粉末（過2號篩）約1 g，精密稱定，置50 mL燒瓶中，加入30%乙醇20 mL，密塞，加熱回流1.5 h，放冷，濾過，濾液置25 mL量瓶中，加30%乙醇稀釋至刻度，搖勻，取續(xù)濾液，即得。

2.4 測定法 在2.1項(xiàng)色譜條件下，分別精密吸取參照物溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，記錄色譜圖，即得。參照物和樣品指紋圖譜見圖1。

圖1 對照品異阿魏酸（A）和樣品（B）的HPLC色譜Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances：iso-ferulate（A），sample（B）

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 取5號樣品，按樣品制備方法進(jìn)行制備，在所建立的測定條件下，連續(xù)進(jìn)樣5次，以異阿魏酸峰位參照峰，實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出色譜圖中各特征峰相對保留時(shí)間的RSD＜0.27%；相對峰面積（特征峰所占比例大于1%）的RSD＜5%，表明精密度良好。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取5號樣品5份，按樣品制備方法進(jìn)行制備，在所建立的測定條件下測定，以異阿魏酸峰位參照峰，實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出色譜圖中各特征峰相對保留時(shí)間的RSD＜0.19%；相對峰面積（特征峰所占比例大于1%）的RSD＜5%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取5號樣品，按樣品制備方法進(jìn)行制備，在所建立的測定條件下，分別在0、1、2、4、8、12 h進(jìn)行測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明各特征峰相對保留時(shí)間的RSD＜0.17%，相對峰面積（特征峰所占比例大于1%）的RSD＜5%，表明樣品的穩(wěn)定性良好。

2.8 測定結(jié)果 取除10號樣品外的11批升麻樣品，按供試品制備方法，在2.1項(xiàng)色譜條件下，分別精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，測定，11批樣品出峰總數(shù)及共有峰所占的比例見表2。

表2 各樣品的出峰總數(shù)及其共有峰所占比例Tab.2 Numbers of sample peaks and proportion of common peaks

使用Excel 2003按照相關(guān)系數(shù)公式和夾角余弦公式［12］分析各個(gè)商品地及兩種炮制品的保留時(shí)間和峰面積，計(jì)算相似度，結(jié)果見表3、表4。

表3 各峰相對保留時(shí)間的夾角余弦和相關(guān)系數(shù)計(jì)算結(jié)果Tab.3 The calculation result of cosine of the angle and correlation coefficient for relative retention times

表4 各峰相對峰面積的夾角余弦和相關(guān)系數(shù)計(jì)算結(jié)果Tab.4 The calculation result of cosine of the angle and correlation coefficient for relative peak areas

10 號樣品的圖譜中未出現(xiàn)參照物異阿魏酸峰，而在計(jì)算各峰相對保留時(shí)間和相對峰面積的夾角余弦和相關(guān)系數(shù)時(shí)，需要將樣品中異阿魏酸峰的保留時(shí)間和峰面積作為1（作為分母），再將其他峰的保留時(shí)間和峰面積與之相比，得出相對保留時(shí)間和相對峰面積，利用得到的數(shù)據(jù)計(jì)算出夾角余弦和相關(guān)系數(shù)。所以10號樣品無法根據(jù)異阿魏酸峰計(jì)算夾角余弦和相關(guān)系數(shù)。10號樣品與其他樣品比較（以1號樣品為例），樣品各峰的保留時(shí)間、與15個(gè)共有峰符合的峰數(shù)見表5。

3 討論

3.1 根據(jù)中華人民共和國藥典中指紋圖譜測定方法，在選定的色譜條件下，建立了9個(gè)不同商品地升麻HPLC指紋圖譜，標(biāo)定出15個(gè)共有指紋峰；2個(gè)常用炮制品的HPLC指紋圖譜，炒炭升麻具有15個(gè)共有特征峰；蜜炙升麻只具有13個(gè)共有特征峰。將炮制品與生品的指紋圖譜相比較可知，升麻經(jīng)炮制前后出峰總數(shù)和峰面積不完全相同，說明有效成分發(fā)生了變化。

表5 1號樣品各峰的保留時(shí)間及其與10號樣品共有峰數(shù)的比較Tab.5 The relative retention time of sample 1 and numbers of common peaks comparison between samples 1 and 10

3.2 實(shí)驗(yàn)通過紫外可見分光光度法測定供試品溶液，發(fā)現(xiàn)在316 nm處有較大吸收，所以選擇316 nm為檢測波長。

3.3 根據(jù)建立的指紋譜圖，1～9批升麻藥材的指紋圖譜中15個(gè)共有峰相對保留時(shí)間符合程度較好，共有峰占總峰面積的90%以上；但各個(gè)峰的相對峰面積存在一定差異，說明不同來源的1～9批升麻藥材質(zhì)量是有差別的。

3.4 從表2可知，各樣品的非共有峰數(shù)差異較大，說明不同來源的升麻所含有的成分存在差別，這可能與藥材生長的地理位置、環(huán)境、氣候、采收季節(jié)和時(shí)間等因素有關(guān)。

3.5 將北京和上海兩地的生、炮制品進(jìn)行比較：包括共有峰在內(nèi)，蜜炙升麻中部分化學(xué)成分顯著增加，異阿魏酸的峰面積有所減?。怀刺可橹挟惏⑽核岬姆迕娣e增加，而其他成分的峰面積顯著減小甚至消失。說明炮制前后升麻所含的化學(xué)成分發(fā)生改變，可以從圖譜中看出。

3.6 由廣東商品地購買的升麻藥材為菊科植物麻花頭的根，主產(chǎn)于廣東、福建等地，在當(dāng)?shù)亓?xí)慣作升麻使用。其特征峰的數(shù)量以及所占的比例均小。本實(shí)驗(yàn)建立升麻的指紋圖譜，而廣東升麻與升麻不屬于同種藥材，所以在數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)時(shí)未加入有關(guān)廣東升麻（10號樣品）的數(shù)據(jù)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)建立的指紋圖譜中特征峰種類和數(shù)目、共有峰相對保留時(shí)間差異等可對升麻進(jìn)行定性鑒別、對同名不同物的藥材加以區(qū)別。實(shí)驗(yàn)建立的指紋圖譜可作為控制升麻及其炮制品內(nèi)在質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)之一。

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WANG Bing， ZHANG Zheng-qiu*， SUN Yan-tao， LI Li， DENG Xue-nan
（College of Pharmacy，Liaoning Univesity of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China）

Cimicifuga；fingerprint

R284.1

A

1001-1528（2011）07-1106-04

2010-06-21

王 冰（1982—），女，碩士生，研究方向：藥物分析。E-mail：wb20040312@163.com

*通信作者：張振秋，男，博士生導(dǎo)師，教授。Tel：（0411）87586058，E-mail：zhangzhenqiu@sina.com

HPLC fingerprint of Cimicifuga and its processed products