雷 紅， 王 毅， 蔡亮亮， 魏 偉

（1.合肥工業(yè)大學生物與食品工程學院，安徽合肥230009；2.合肥恒星藥物研究所，安徽合肥 230051）

利血康抗阿糖胞苷性血小板減少癥作用的實驗研究

雷 紅1， 王 毅1， 蔡亮亮1， 魏 偉2

（1.合肥工業(yè)大學生物與食品工程學院，安徽合肥230009；2.合肥恒星藥物研究所，安徽合肥 230051）

目的 研究利血康顆粒（三七、白及、藕節(jié)等）抗小鼠阿糖胞苷性血小板減少癥模型的作用。方法 采用小鼠阿糖胞苷性血小板減少癥模型，同時灌服利血康顆粒 3 種劑量 2.25、1.13、0.56 g/kg（折合生藥 9、4.5、2.25 g/kg，ig）治療 8 d，觀察藥物對該動物模型凝血時間、外周血血小板（Bpc）數(shù)、骨髓巨核細胞數(shù)和骨髓DNA的影響。結(jié)果 利血康顆粒高、中劑量可明顯縮短阿糖胞苷性血小板減少癥模型小鼠的凝血時間、升高外周血Bpc數(shù)、骨髓巨核細胞數(shù)和骨髓DNA。結(jié)論 利血康顆粒對小鼠阿糖胞苷性繼發(fā)性血小板減少癥模型具有拮抗作用，該作用與其促進骨髓造血干細胞尤其是骨髓巨核細胞的分化增殖，減輕骨髓抑制有關。

利血康顆粒；阿糖胞苷；血小板減少癥

血小板減少癥是血液內(nèi)科的常見病，目前臨床用于治療血小板減少癥的藥物主要為腎上腺皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等。近年來越來越多的學者采用中醫(yī)藥或中西醫(yī)結(jié)合治療血小板減少癥。因此，根據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)學理論，結(jié)合臨床應用研究的成果，我們研制開發(fā)了利血康顆粒。利血康顆粒由三七、白及、藕節(jié)炭等組成，臨床應用多例療效良好。本實驗通過復制小鼠阿糖胞苷性血小板減少癥模型，觀察利血康顆粒對繼發(fā)性血小板減少癥的防治作用，為新藥研究及臨床應用提供藥效學依據(jù)，并探討其升高血小板的作用機理。

1 材料與方法

1.1 動物 昆明種小白鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，購于安徽省醫(yī)學科學研究所實驗動物中心，合格證：皖醫(yī)實動準字第03號。

1.2 藥物與試劑 利血康顆粒內(nèi)容物（干浸膏粉），合肥恒星藥物研究所提供，1 g干浸膏折合總生藥4 g。陽性對照藥：血康口服液，主要成分為腫節(jié)風等提取的黃酮苷、氰苷、延胡索酸、琥珀酸等，規(guī)格10 mL/支，江西天獅中藥集團貴溪制藥廠。注射用鹽酸阿糖胞苷（Ara-C），規(guī)格50 mg/支，上海華聯(lián)制藥有限公司。其余試劑均為分析純。

1.3 儀器 高速冷凍離心機（Beckman，HJM6）；85081型倒置光學顯微鏡（重慶光學儀器廠）；EL301 Strip reader酶標儀（美國BIO-TEK公司）；530紫外分光光度計（YLS-SOP-002，上海分析儀器廠）。

1.4 方法

1.4.1 小鼠阿糖胞苷性血小板減少癥模型［1-2］、分組與給藥 小鼠60只，隨機分為6組：正常對照組、模型組、利血康顆粒高、中、低3個劑量組（2.25、1.13、0.56 g 干浸膏/kg，折合 9、4.5、2.25 g 生藥/kg）、陽性對照組，每組10只，雌雄各半。除正常對照組外，每組小鼠腹腔注射Ara-C 100 mg/（kg·d），連續(xù)2 d，第3天 ip Ara-C 50 mg/（kg·d），連續(xù)3 d。于注射同時每日灌胃給藥，正常和模型對照組灌胃等容積蒸餾水，連續(xù)給藥8 d。每日觀察動物的一般狀況、活動、感染、出血、攝食等。每周稱體質(zhì)量2次，并以此來調(diào)整用藥量。陽性對照組小鼠ig血康口服液稀釋液0.2 mL/kg。

1.4.2 凝血時間測定［3-4］于給藥前1 d與末次給藥1 h后毛細管眼眶取血，滴于載波片，血滴直徑約5 mm，立即用秒表記時。用清潔的4號注射針頭自血滴邊緣向里輕輕撥動，觀察有無血絲挑起，從采血開始至挑起血絲止即為凝血時間。

1.4.3 血細胞計數(shù) 剪尾采血，采用顯微鏡人工計數(shù)Bpc，嚴格按《全國臨床檢驗操作規(guī)程》中《血小板計數(shù)》的“目視計數(shù)法”操作［5］。于給藥前1 d與給藥結(jié)束后1 d進行。以Bpc變化率表示結(jié)果：Bpc變化率=（給藥前Bpc數(shù)－給藥后Bpc數(shù)）/給藥前Bpc數(shù)×100%。

1.4.4 骨髓細胞涂片檢查 取一側(cè)完整股骨，除凈軟組織，剪去股骨兩端，取0.1 mL生理鹽水反復沖洗股骨腔，將沖洗液涂片（2 cm×2 cm），經(jīng)瑞氏染色，先在4×鏡下全片瀏覽，再在10×鏡下計數(shù)20個視野內(nèi)的巨核細胞數(shù)，報告每個視野（10×）巨核細胞的平均數(shù)。

1.4.5 骨髓DNA測定［6］取另一側(cè)完整股骨，除凈軟組織，用0.005 mol/L CaCl210 mL將全部骨髓沖入離心管中，4℃下靜置30 min，離心（2 500 r/min，15 min），棄上清液，沉淀物加 0.2 mol/L HClO45 mL充分混合，90℃水浴15 min，冷卻，過濾，濾液定容至15 mL，紫外分光光度計268 nm處測定吸光度A值。

2 結(jié)果

2.1 對阿糖胞苷血小板減少癥小鼠凝血時間的影響 與正常對照組比較，模型組小鼠凝血時間明顯延長（P＜0.01）；利血康顆粒高、中劑量及血康口服液均可使凝血時間明顯縮短（P＜0.01或P＜0.05）。見表1。

表1 利血康顆粒對阿糖胞苷血小板減少癥小鼠凝血時間（s）的影響 （±s，n=10）Tab.1 Effect of Lixuekang Granules on coagulation time of Ara-C-induced thrombocytopenia mice （ˉx ± s，n=10）

表1 利血康顆粒對阿糖胞苷血小板減少癥小鼠凝血時間（s）的影響 （±s，n=10）Tab.1 Effect of Lixuekang Granules on coagulation time of Ara-C-induced thrombocytopenia mice （ˉx ± s，n=10）

注：與正常組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01；與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01。Note：*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs normal group；#P ＜0.05，##P ＜0.01，vs model group.

組別 劑量 給藥前/s 給藥后/s正常對照 —110.79 ±33.92 116.46 ±41.67模型對照 — 121.32±40.63 257.68±53.46＊＊利血康顆粒 2.25 g干浸膏/kg 125.87 ±30.73 156.36 ±35.77*##1.13 g干浸膏/kg 117.65 ±32.71 181.28 ±43.81＊＊##0.56 g干浸膏/kg 120.49 ±41.23 216.72 ±45.83＊＊血康口服液 0.2 mL/10 g 109.27 ±28.31 182.39 ±51.62*#

2.2 對阿糖胞苷血小板減少癥小鼠外周血Bpc的影響 與正常對照組比較，模型組小鼠外周血Bpc數(shù)明顯降低（P＜0.01）。利血康顆粒高、中劑量及血康口服液均可使減少的Bpc數(shù)明顯升高（P＜0.01或P＜0.05），見表2。

2.3 對阿糖胞苷血小板減少癥小鼠骨髓巨核細胞數(shù)的影響 與正常對照組比較，模型組小鼠骨髓巨核細胞數(shù)明顯降低（P＜0.01）；利血康顆粒高劑量及血康口服液均可使降低的骨髓巨核細胞數(shù)明顯升高（P＜0.01），見表3。

2.4 對阿糖胞苷血小板減少癥小鼠骨髓DNA量的影響 與正常對照組比較，模型組小鼠骨髓DNA量明顯降低（P＜0.01）；利血康顆粒高、中劑量可使降低的骨髓DNA量明顯升高（P＜0.01），見表4。

表2 利血康顆粒對阿糖胞苷血小板減少癥小鼠外周血Bpc的影響（±s，n=10）Tab.2 Effect of Lixuekang Granules on circulating platelet number of Ara-C-induced thrombocytopenia mice （ˉx ± s，n=10）

表2 利血康顆粒對阿糖胞苷血小板減少癥小鼠外周血Bpc的影響（±s，n=10）Tab.2 Effect of Lixuekang Granules on circulating platelet number of Ara-C-induced thrombocytopenia mice （ˉx ± s，n=10）

注：與正常組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01；與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01。Note：*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs normal group；#P ＜0.05，##P ＜0.01，vs model group.

組別 劑量 給藥前Bpc數(shù)/（×109/L） 給藥后Bpc數(shù)/（×109/L） Bpc變化率/%正常對照 —714.44 ±139.41 677.22 ±108.87 4.07 ±12.39模型對照 — 864.50±181.01 430.80±121.26＊＊ 49.85±12.59＊＊利血康顆粒 2.25 g干浸膏/kg 973.78 ±239.28 731.44 ±147.77## 23.08 ±14.00＊＊##1.13 g干浸膏/kg 824.89 ±217.33 557.56 ±146.00 30.59 ±16.54＊＊#0.56 g干浸膏/kg 762.10 ±239.74 483.50 ±210.33* 36.89 ±14.99＊＊血康口服液 0.2 mL/10 g 818.13 ±178.42 544.25 ±111.62* 32.34 ±14.46＊＊#

表3 利血康顆粒對阿糖胞苷血小板減少癥小鼠骨髓巨核細胞數(shù)的影響（±s，n=10）Tab.3 EffectofLixuekang Granuleson marrow megakaryocytes number of Ara-C-induced thrombocytopenia mice （ˉx ± s，n=10）

表3 利血康顆粒對阿糖胞苷血小板減少癥小鼠骨髓巨核細胞數(shù)的影響（±s，n=10）Tab.3 EffectofLixuekang Granuleson marrow megakaryocytes number of Ara-C-induced thrombocytopenia mice （ˉx ± s，n=10）

注：與正常組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01；與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01。Note：*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs normal group；#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs model group.

組別 劑量 骨髓巨核細胞數(shù)/（個/視野）正常對照 —1.08 ±0.38模型對照 — 0.31±0.09＊＊利血康顆粒 2.25 g干浸膏/kg 0.80 ±0.20##1.13 g干浸膏/kg 0.38 ±0.26＊＊0.56 g干浸膏/kg 0.34 ±0.09＊＊血康口服液 0.2 mL/10 g 0.80 ±0.30##

表4 利血康顆粒對阿糖胞苷血小板減少癥小鼠骨髓DNA的影響（±s，n=10）Tab.4 Effect of Lixuekang Granules on marrow DNA content of Ara-C-induced thrombocytopenia mice（ˉx ± s，n=10）

表4 利血康顆粒對阿糖胞苷血小板減少癥小鼠骨髓DNA的影響（±s，n=10）Tab.4 Effect of Lixuekang Granules on marrow DNA content of Ara-C-induced thrombocytopenia mice（ˉx ± s，n=10）

注：與正常組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01；與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01。Note：*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs normal group；#P ＜0.05，##P ＜0.01，vs model group.

組別 劑量 骨髓DNA量吸光度A值正常對照 —0.667 ±0.112模型對照 — 0.396±0.046＊＊利血康顆粒 2.25 g干浸膏/kg 0.546 ±0.107*##1.13 g干浸膏/kg 0.475 ±0.036＊＊##0.56 g干浸膏/kg 0.442 ±0.095＊＊血康口服液 0.2 mL/10 g 0.398 ±0.057＊＊

3 討論

血小板減少癥病因可為繼發(fā)性如化療藥物、放射治療引起，或原發(fā)性如特發(fā)性血小板減少性紫癜（ITP）等。化療藥物引起的血小板減少，多與其抑制骨髓造血干細胞，尤其是骨髓巨核細胞的分化增殖有關［7］。阿糖胞苷臨床上用于治療急性粒細胞白血病和腫瘤；其通過阻礙核酸代謝和DNA合成，抑制骨髓造血干細胞，引起血小板減少，故可用于造成繼發(fā)性血小板減少動物模型的實驗研究［2］。

利血康顆粒是由三七、白及、藕節(jié)炭等組成的中成藥，來源于古方“安血飲”加減，功具活血化瘀，收斂止血之效，可用于瘀血內(nèi)阻之出血證。本實驗通過小鼠阿糖胞苷性血小板減少癥動物模型，研究了利血康顆粒治療繼發(fā)性血小板減少癥的作用及其機理。結(jié)果表明，利血康顆粒可明顯延長阿糖胞苷性血小板減少癥模型小鼠的凝血時間、升高外周血血小板數(shù)，并可升高骨髓巨核細胞數(shù)和骨髓DNA量。說明利血康顆粒對小鼠阿糖胞苷性血小板減少癥模型具有明顯的治療作用；其作用機理與其促進骨髓造血干細胞，尤其是骨髓巨核細胞的分化增殖，減輕骨髓抑制有關。本實驗為利血康顆粒用于繼發(fā)性血小板減少癥的治療提供了藥效學依據(jù)。

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［3］陳 奇.中藥藥理研究方法學［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1994：484-484.

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［5］中華人民共和國衛(wèi)生部醫(yī)政司.全國臨床檢驗操作規(guī)程［M］.南京：東南大學出版社，1997：22-23.

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［7］都麗萍，梅 丹.藥源性血小板減少癥的發(fā)病機制和臨床表現(xiàn)及防治［J］.藥物不良反應雜志，2007，9（6）：414-419.

Experimental study on anti-cytarabine（Ara-C）-induced thrombocytopenia effect of Lixuekang Granules

LEI Hong1， WANG Yi1， CAI Liang-liang1， WEI Wei2
（1.College of Biological and Food Engineering，Hefei University of Technology，Hefei 230009，China；2.Hefei Hengxing Pharmaceutical Institute，Hefei 230051，China）

AIMTo explore the effect of Lixuekang Granules（Notoginseng Radix et Rhizoma，Bletillae Rhizoma，Nelumbinis Rhizomatis Nodus，etc）on mice model of cytarabine（Ara-C）-induced thrombocytopenia.METHODSAra-C-induced thrombocytopenia mice model was adopted.The model was intragastrically given three doses of Lixuekang Granules 2.25，1.13，0.56 g/kg（equivalent to 9，4.5，2.25 g/kg crude drugs）for eight days simultaneously.Coagulation time of mice，circulating platelet counting，marrow megakaryocytes counting and marrow DNA content were investigated.RESULTS2.25，1.13 g/kg of Lixuekang Granules could shorten the coagulation time，elevate circulating platelet counting，marrow megakaryocytes counting and marrow DNA content of Ara-C-induced thrombocytopenia mice markedly.CONCLUSIONLixuekang Granules have the effect of anti-secondary thrombocytopenia induced by Ara-C，which may be related to its promoting differentiation and proliferation of marrow hemopoietic stem cells，especially marrow megakaryocytes and alleviating marrow inhibitory effect.

Lixuekang Granules；cytarabine（Ara-C）；thrombocytopenia

R285.5

A

1001-1528（2011）07-1113-03

2010-07-21

雷 紅（1973—），女，副教授，博士，碩士生導師，研究方向：天然產(chǎn)物純化與作用機理。E-mail：leihong66@sohu.com