張珍 ，閔 瑋 ，林秉獎(jiǎng) ，駱 丹

（1.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南京 210029；2.蘇州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，蘇州 215006；3.寧波市第一人民醫(yī)院，寧波 315000）

近年來(lái)發(fā)現(xiàn)黃芩苷具有抗菌、抗病毒、抗感染、抗氧化及清除氧自由基和抗腫瘤等藥理作用。本研究小組的先期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，黃芩苷處理可以有效減輕皮膚細(xì)胞光損傷，減少細(xì)胞凋亡率和抑制炎癥介質(zhì)分泌[1]。但黃芩苷對(duì)生理狀態(tài)下皮膚細(xì)胞的影響，尤其是其作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)目前還欠深入。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)雙向凝膠電泳和質(zhì)譜技術(shù)研究黃芩苷對(duì)人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT株差異表達(dá)蛋白的影響，以進(jìn)一步闡明黃芩苷具有的生物學(xué)活性和對(duì)皮膚細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和試劑 丙烯酰胺(acrylamide)、甲叉雙丙烯酰胺(N,N’-Methylenebisacrylamide)、四甲基乙二胺(TEMED)、過(guò)硫酸胺（APS）、固相 PH 梯度（immobilized PH gradient）膠條（24cm PH3～10NL）、三羥甲基氨基甲烷 (Tris)、超純尿素、二硫蘇糖醇(DTT)、3-[(3-膽酰胺醛)-二乙胺]-丙磺酸（CHAPS）、碘乙酰胺（IAA）、低熔點(diǎn)瓊脂糖均為瑞典Amersham公司產(chǎn)品；十二烷基磺酸鈉(SDS)、序列修飾后胰蛋白酶（modified trypsin）為美國(guó)Promega公司產(chǎn)品；蛋白酶抑制劑cocktail、中低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（118、85、47、36、26KDa）、乙晴（CAN）、三氟乙酸（TFA）均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；黃芩苷購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

IPGphor聚焦系統(tǒng)、Ettan DaltⅡ垂直電泳系統(tǒng)、ImageScanner TM掃描儀、ImageMaster凝膠分析軟件、SDS-PAGE灌膠裝置均為瑞典Amesham公司產(chǎn)品；MALDI-MS質(zhì)譜儀BIFLEXⅣ為德國(guó)Bruker公司產(chǎn)品；低溫超高速離心機(jī)為德國(guó)Beckman公司；細(xì)胞超聲破碎儀為美國(guó)SONICS公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 在37℃、5%CO2條件下將永生化角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)于細(xì)胞培養(yǎng)箱中。80%融合時(shí)，以0.25%胰酶消化，用含10%小牛血清的1640培養(yǎng)基調(diào)整其濃度為1×106/mL，定量接種于10cm培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、黃芩甘孵育組。黃芩甘孵育組以終濃度200μg/mL黃芩苷孵育HaCaT細(xì)胞并培養(yǎng)48h。

1.2.2 細(xì)胞總蛋白抽提 按每1.5×106個(gè)細(xì)胞加入細(xì)胞裂解夜50μl/L的比例加入裂解夜，冰水浴中進(jìn)行超聲（150w，超聲 3s，間隔 30s，共5次），超聲結(jié)束后裂解夜轉(zhuǎn)為澄清。室溫放置1h，其間每隔15min渦旋一次×3s。4℃，40000g離心 1h，收集上清，40μl/L管分裝，Bradford法定量蛋白，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳

1.2.3.1 固相梯度等電聚焦電泳及平衡 選取24cm的IPG膠條，銀染上樣量為90μg。第一向等電聚焦按如下程序自動(dòng)進(jìn)行：①低電壓水化，30v 6h；60v 6h；②升壓，500v 1h step；1 000v 1h step；③等電聚焦，8 000v step約10h。待24cm膠條等電聚焦達(dá)到80 000vhr，13cm膠條等電聚焦達(dá)到30 000vhr時(shí)，第一向等電聚焦結(jié)束。電泳完畢后，從膠條槽中取出膠條，膠條平衡緩沖液Ⅰ10mL輕微振蕩平衡15min，再換膠條平衡緩沖液Ⅱ10mL輕微振蕩15min。SDS電泳緩沖液中清洗，濾紙吸干多余水分。

1.2.3.2 SDS聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳 配制濃度為12.5%的均一的SDS聚丙烯酰胺分離凝膠，將已經(jīng)平衡好的IPG膠條置于第二向凝膠頂端，用低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液封膠條，排盡膠條與凝膠面之間的氣泡。上Marker，待低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液凝固后，將凝膠轉(zhuǎn)移入垂直電泳槽。用Ettan-DaltⅡ垂直電泳儀進(jìn)行電泳，24cm膠條參數(shù)設(shè)置為P1 2w/膠，1h；P2 5w/膠30min；P3 15w/膠10h。在溴酚蘭前緣運(yùn)行到凝膠底部邊緣時(shí)，終止電泳。24cm膠條一般垂直電泳運(yùn)行時(shí)間為7h。銀染后顯色，終止10min后以去離子水洗10min×2次，保存待用。

1.2.3.3 圖象采集及圖譜分析 染色后的雙向電泳凝膠用ImageScanner TM掃描儀進(jìn)行透射掃描，數(shù)字化圖象文件運(yùn)用Amersham Pharmacia公司的ImageMasterR 2DElite(Version 2.00)軟件分析。

1.2.4 質(zhì)譜分析 使用蛋白質(zhì)點(diǎn)酶切法：去離子水洗膠，用直徑1.5mm槍頭從槍上取點(diǎn)，盡可能將目的點(diǎn)取完整；質(zhì)譜樣品點(diǎn)樣：將樣品和基質(zhì)按1∶1等體積混合后吸取1μL點(diǎn)樣于點(diǎn)樣靶上，干燥晾干；肽質(zhì)量指紋圖譜的檢測(cè)：在延遲解吸和反射模式下進(jìn)行譜圖采集，激光波長(zhǎng)337nm，加速電壓設(shè)置19KV。每一個(gè)肽譜圖大約是由200次轟擊壘加而成，外標(biāo)采用布魯克公司肽混合物標(biāo)準(zhǔn)品，內(nèi)標(biāo)采用胰蛋白酶的自切峰，分別為m/z 842.50和m/z 2211.10。洗靶：檢測(cè)結(jié)束后，用0.1%TFA洗靶30s～1min后吸棄。

1.2.5 數(shù)據(jù)庫(kù)查詢 用Mascot搜索引擎（http://www.matrixscience.com//mascot/cgi/search_form.pl?FORMVER=2&SEARCH=PMF）進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索。檢索條件：蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)選擇SwissProt庫(kù)，物種來(lái)源選擇人，酶選擇Trypsin，允許不完全的酶解片段選擇為1個(gè)，肽片段分子量最大允許誤差為50ppm，離子選擇為MH+。

2 結(jié)果

2.1 黃芩苷孵育前后HaCaT細(xì)胞的雙向凝膠電泳結(jié)果 收集黃芩苷孵育前、后HaCaT細(xì)胞進(jìn)行雙向凝膠電泳，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，得到的銀染圖譜如圖1所示。

圖1 黃芩苷孵育前后HaCaT細(xì)胞雙向電泳凝膠圖譜(銀染)

2.2 黃芩苷對(duì)2-DE圖譜中差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的影響及肽質(zhì)量指紋譜鑒定 在培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞中加入黃芩苷孵育后，與對(duì)照組相比共篩選出38個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)。從中隨機(jī)抽取部分（18個(gè)）蛋白點(diǎn)進(jìn)行肽質(zhì)量指紋譜鑒定。其中1個(gè)點(diǎn)（spot1703）僅在對(duì)照組HaCaT細(xì)胞中表達(dá)，另2個(gè)點(diǎn)（spot 1805、2151）僅在經(jīng)黃芩苷孵育的HaCaT細(xì)胞中表達(dá)；10 個(gè) 點(diǎn) （spot 1242、1396、1421、1458、1511、1573、1858、1914、2336、2410） 經(jīng)黃芩苷孵育后在 HaCaT細(xì)胞中高表達(dá)，5 個(gè)點(diǎn)（spot502、3253、3334、3335、3967）在黃芩苷孵育后的HaCaT細(xì)胞中低表達(dá)。經(jīng)搜索Swiss Prot蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)綜合分析，并去除未知蛋白，在18個(gè)差異蛋白點(diǎn)中共成功鑒定14個(gè)蛋白點(diǎn)，具體數(shù)據(jù)庫(kù)查詢結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 差異蛋白質(zhì)點(diǎn)質(zhì)譜分析結(jié)果

3 討論

現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)證實(shí)黃芩苷有抗變態(tài)、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、清除自由基等藥理作用。此外，黃芩苷還具有較強(qiáng)的抗癌作用，抑制腫瘤細(xì)胞增殖、分化，誘導(dǎo)其凋亡和抑制血管生成。我們的前期研究證實(shí)黃芩苷可抑制急性光損傷皮膚細(xì)胞如角質(zhì)形成細(xì)胞（KC）和成纖維細(xì)胞（FB）中光產(chǎn)物的產(chǎn)生，加速DNA損傷修復(fù)，提示黃芩苷在阻止皮膚光源性損傷進(jìn)程中有重要作用[2]。但是關(guān)于黃芩苷對(duì)生理狀態(tài)皮膚細(xì)胞的影響方面目前還少有研究。本實(shí)驗(yàn)中我們使用終濃度為200μg/mL的黃芩苷與HaCaT細(xì)胞共孵育，并利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測(cè)黃芩苷對(duì)細(xì)胞蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果共篩選出38個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，選取其中18個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，進(jìn)行質(zhì)譜分析，獲得15個(gè)點(diǎn)的肽質(zhì)量指紋圖譜，初步鑒定為熱休克蛋白beta-1、肌動(dòng)蛋白、二氫嘧啶酶調(diào)節(jié)蛋白2等。

受黃芩苷作用而下調(diào)的蛋白主要是二氫嘧啶酶相關(guān)蛋白-2(dihydropyrimidinase-related protein 2,Dpysl2)和核纖層蛋白C（lamin C），它們都屬于細(xì)胞骨架蛋白。Dpysl2通過(guò)與微管蛋白異二聚體結(jié)合促進(jìn)微管形成。Lamin參與形成貫穿于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的骨架結(jié)構(gòu)體系，還參與DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和損傷修復(fù)、維持染色體結(jié)構(gòu)與基因組穩(wěn)定性等[3]。細(xì)胞骨架通過(guò)有序的解聚和重排為細(xì)胞運(yùn)動(dòng)提供動(dòng)力。惡性腫瘤細(xì)胞常表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)和遷移能力增加，對(duì)于細(xì)胞骨架的抑制能力是很多抗腫瘤藥物的治療靶點(diǎn)。本研究中，黃芩苷可以明顯抑制生理狀態(tài)的培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞中Dpysl2和Lamin C兩種細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)水平，表明黃芩苷有可能通過(guò)作用于細(xì)胞骨架而降低細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力。這可能是黃芩苷抗腫瘤生物活性的機(jī)制之一。

熱休克蛋白27(heatshock protein 27,HSP27)在黃芩苷共孵育時(shí)表達(dá)上調(diào)。HSP27可保護(hù)細(xì)胞抵抗各種刺激引起的細(xì)胞凋亡，HSP27在應(yīng)激狀態(tài)下表達(dá)增高，可提高細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力[4]。此外，HSP27還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化等。本研究中發(fā)現(xiàn)黃芩苷可在生理狀態(tài)的HaCaT細(xì)胞中引起HSP27表達(dá)增高，表明黃芩苷可有效提高皮膚細(xì)胞抗應(yīng)激損傷的防御能力，這對(duì)保護(hù)細(xì)胞抵抗各種環(huán)境刺激因素，包括紫外線輻射損傷方面具有積極意義。

黃芩苷還可上調(diào)HaCaT細(xì)胞中26S蛋白酶體調(diào)節(jié)亞基 7（26Sprotease regulatory subunit7）和蛋白酶體激活因子亞基2(proteasome activator subunit2)的表達(dá)水平。它們均與26S蛋白酶體活性密切相關(guān)，后者是泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome pathway,UPP)的重要組成部分。UPP可高效并高選擇性地降解細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，參與細(xì)胞多種生理活動(dòng)過(guò)程，如細(xì)胞凋亡、MHCⅠ類抗原的遞呈、細(xì)胞周期以及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)等，對(duì)維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)和正常的生理功能具有十分重要的意義。因此黃芩苷上調(diào)HaCaT細(xì)胞中26S蛋白酶體調(diào)節(jié)亞基7和蛋白酶體激活因子亞基2的表達(dá)水平，將有助于增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，提高對(duì)突變和環(huán)境刺激損傷的監(jiān)控與防御能力。

黃芩苷還可以調(diào)高另外兩個(gè)細(xì)胞骨架蛋白，原肌球蛋白(tropomyosin,TM)異構(gòu)體和肌動(dòng)蛋白(actin)的表達(dá)水平。Actin參與細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、分裂和原質(zhì)的流動(dòng)，動(dòng)物胞囊和器官的運(yùn)動(dòng)，細(xì)胞間信息的傳遞，以及細(xì)胞的形狀和連結(jié)的建立和維持等[5]。TM在細(xì)胞移動(dòng)、形態(tài)發(fā)生和胞漿移動(dòng)中調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白絲的動(dòng)態(tài)變化。黃芩苷對(duì)TM和Actin的促表達(dá)作用可能有助于增強(qiáng)細(xì)胞形態(tài)及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。

綜上所述，黃芩苷可通過(guò)上調(diào)HSP27等多種蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)和抵抗環(huán)境刺激損傷的能力，同時(shí)黃芩苷可能通過(guò)影響Lamin C等細(xì)胞骨架蛋白而發(fā)揮抗腫瘤活性。這些結(jié)果有助于我們加深對(duì)黃芩苷生理活性和對(duì)皮膚細(xì)胞影響的理解，為黃芩苷在皮膚科領(lǐng)域的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

［1］ 閔瑋，駱丹，林向飛.黃芩苷對(duì)皮膚細(xì)胞紫外線輻射損傷的保護(hù)作用[J].徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，24（2）：167-170.

［2］ Bing-Rong Z,Song-Liang J,Xiao-EC,etal.Protectiveeffectof the Baicalin againstDNA damage induced by ultravioletB irradiation to mouse epidermis[J].Photodermatol Photoimmunol Photomed,2008,24:175-182.

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