黃銀芝，周 秦，黃有軍，曾燕如

（浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安 311300）

植物油脂在植物生長、發(fā)育和繁衍過程中扮演著重要的角色。合成后的植物油脂主要有2個去向：一是用來構(gòu)成生物膜的甘油脂和磷脂，另一個是儲藏在種子中，即儲藏態(tài)脂，常以甘油三酯（TAG）的形式存在。儲藏態(tài)脂是一種封閉的相對惰性的光合產(chǎn)物，其主要成分的改變不影響植物總的分解功能，因此，植物油脂的生物合成途徑特別適合遺傳操作[1]。山核桃Carya cathayensis為浙江省重要的經(jīng)濟樹種，其種仁的含油率平均達(dá)到70.0%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過油菜Brassica campestris新品系 “超油2號”（52.8%）和 “世界油王”油棕Elaeis guineensis（55.0%）[2]，為高含油量的樹種，且其油質(zhì)多為不飽和脂肪酸。因此，推測山核桃果實發(fā)育的過程中可能存在其特有的脂肪代謝機制。互補脫氧核糖核酸（cDNA）文庫的構(gòu)建基于基因表達(dá)過程產(chǎn)生的信使核糖核酸（mRNA）。通過構(gòu)建cDNA文庫能直接分離到生命過程中的一些調(diào)控基因，了解這些基因編碼蛋白質(zhì)的相互作用關(guān)系，估計大多數(shù)基因的表達(dá)水平，并發(fā)現(xiàn)一些組織特異的基因。本研究以糖類轉(zhuǎn)變成油脂并積累時期的山核桃果實為材料構(gòu)建cDNA文庫，以期深入研究脂肪代謝的分子調(diào)控機制，挖掘和鑒定更多的脂肪代謝及調(diào)控的關(guān)鍵基因。

1 材料與方法

1.1 材料

cDNA文庫構(gòu)建用的山核桃果實采自山核桃產(chǎn)區(qū)浙江省臨安市板橋鄉(xiāng)羅塘村（30°N，119°E）1株約40年生正值盛果期的山核桃樹，現(xiàn)場采集的果實置于液氮速凍后帶回實驗室－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 文庫構(gòu)建用果實采集時間的確定 生物體每時每刻都有大量不同的基因因生命活動的需要在不同的時間啟動表達(dá)。要構(gòu)建山核桃糖類轉(zhuǎn)變成油脂相關(guān)的cDNA文庫，首先要確定采樣時間，以便在后續(xù)的研究中獲得感興趣的基因片段。周秦等[3]根據(jù)山核桃種仁中粗脂肪含量的變化規(guī)律，利用差異顯示反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（DDRT-PCR）方法對果實成熟期（8月1日至9月4日）基因的表達(dá)進(jìn)行了分析，獲得了30條與脂肪酸代謝相關(guān)的基因（包括油體鈣蛋白、脂肪酶、脂肪酸去飽和酶、脂肪酰輔酶A結(jié)合蛋白和蘋果酸合成酶）高度同源的cDNA片段，并發(fā)現(xiàn)這些片段多出現(xiàn)在8月11日至8月23日采集的樣品中，推斷這個時期是油脂形成、轉(zhuǎn)化、積累的關(guān)鍵時期[4]。在此基礎(chǔ)上，本研究以同年8月11日至8月23日共6次采集的果實樣品為材料，構(gòu)建cDNA文庫。

1.2.2 mRNA的提取 周秦等[5]參考Laura等[6]提取總RNA的方法，在酸酚 ∶氯仿 ∶異戊醇（25∶24∶1）抽提、沉淀核酸的溫度和時間、溶解初次沉淀物的方式等方面進(jìn)行了改進(jìn)。本研究采用周秦等改進(jìn)的方法提取總RNA，提取的總RNA用 DNase I（RNase Free；TaKaRa）消化 DNA，并進(jìn)行電泳檢測。確認(rèn)總RNA未降解后，將6次樣品提取的總RNA等量混合。用mRNA Isolation Systems Kit（Promega）從混合的總RNA中分離mRNA，并進(jìn)行電泳檢測，用紫外分光光度計（ND-1000，NanoDrop）確定濃度。

1.2.3 文庫的構(gòu)建 以提取的mRNA為材料，用SMARTTMcDNA Library Construction Kit（Clontech）構(gòu)建cDNA文庫，但實際操作時有所不同。在構(gòu)建文庫過程中，分級后的雙鏈cDNA先與λTriplEx2 Vector連接，然后參照周祥明[7]的方法，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法檢測各連接混合物的連接效率，取200 bp處特異擴增條帶信號最弱的連接產(chǎn)物用于噬菌體包裝。文庫的宿主菌為Escherichia coli‘HST08’。按照試劑盒說明書計算未擴增文庫的滴度，并用試劑盒提供的測序引物 （5’sequencing primer TCCGAGATCTG GACGAGC/3’sequencing primer TAATACGACTCACTATAGGG）檢測插入片段的大小。初級文庫經(jīng)擴增后的文庫即為λ噬菌體文庫。參照文庫構(gòu)建試劑盒的說明，將λTriplEx 2克隆轉(zhuǎn)變成pTriplEx 2，以pTriplEx 2測序引物序列（5’sequencing primer TCCGAGATCTGGACGAGC/3’sequencing primer TAATACGACTCACTATAGGG）直接對含有pTriplEx2的宿主菌（大腸肝菌Escherichia coli）液進(jìn)行PCR，檢測文庫插入片段的大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA及mRNA的提取

提取的總RNA經(jīng)電泳檢測，28 s rRNA條帶與18 s rRNA條帶都很清楚，且亮度比例約為2∶1，而5 s rRNA條帶亮度較暗，表明提取的總RNA完整性較好，不存在降解現(xiàn)象。經(jīng)過基因組DNA消化后，可完全除去總RNA中的DNA污染，且總RNA也基本未發(fā)生降解（圖1）。

高質(zhì)量的mRNA是構(gòu)建cDNA文庫的基礎(chǔ)。在不同的物種、不同組織mRNA彌散范圍的大小有所不同[8]。本研究中對獲得的mRNA電泳檢測，發(fā)現(xiàn)其在0.5～2.0 kb呈均勻彌散狀分布（圖2），分光光度計檢測其D（λ）260/D（λ）280=1.86，說明純度較高，也即mRNA質(zhì)量很好，可以用于后續(xù)cDNA文庫的構(gòu)建。

2.2 cDNA的合成與分級分離檢測

圖1 總RNA電泳圖泳道1：總RNA；泳道2：消化基因組DNA后的總RNAFigure1 Electrophoresis of the total RNA extractedlane 1：total RNA extracted；and lane 2：total RNA after DNA is digested

mRNA反轉(zhuǎn)錄后合成雙鏈cDNA。雙鏈cDNA在0.1～3.0 kb呈彌散狀，集中分布在0.5～2.0 kb，與試劑盒所帶的對照cDNA大小相近（圖3）。cDNA集中彌散的范圍與分離的mRNA相似，說明反轉(zhuǎn)錄較為成功，雙鏈cDNA的質(zhì)量能夠滿足構(gòu)建cDNA文庫的要求。

由于cDNA與載體連接的過程中往往小片段優(yōu)先連接。為了得到高質(zhì)量的cDNA文庫，必須去除雙鏈cDNA中的小片段。本研究中使用CHROMA SPIN-400對cDNA片段進(jìn)行分級分離，舍棄400 bp以下的小片段。分級分離的結(jié)果電泳如圖4所示，將圖4中與泳道6，7，8相對應(yīng)的分離產(chǎn)物合并后進(jìn)行后續(xù)的操作。

圖2 mRNA電泳圖泳道1：mRNA；泳道2：λ-hindⅢ消化DNA標(biāo)記Figure2 Electrophoresis of isolated mRNAlane 1：mRNA；and lane 2：λ-hindⅢ digest DNA marker

圖3 雙鏈cDNA電泳圖泳道1：雙鏈cDNA；泳道2：對照cDNA；泳道3：λ-hindⅢ DNA消化標(biāo)記 （從下到上標(biāo)記的大小依次為：125 bp，564 bp，2027 bp，2322 bp，4361 bp，6557 bp，9416 bp，23130 bp）；泳道 4：100 bp 以上DNA梯度標(biāo)記Figure3 Electrophoresis of ds cDNAslane 1：ds cDNA；lane 2：control cDNA；lane 3：λ-Hind Ⅲ digest DNA marker；and lane 4：100 bp plus DNA ladder marker

圖4 雙鏈cDNA大小片段的分級分離泳道M1：DL2000標(biāo)記；泳道M2：100 bp以上DNA梯度標(biāo)記；泳道1～15：雙鏈cDNAFigure4 The ds cDNA size fractionslane M1：DL2000 marker；lane M2：100 bp plus DNA ladder marker；and lanes 1－15：cDNA

2.3 連接效率的檢測

cDNA與載體λTripIEx 2連接時采用了3種cDNA：λTripIEx 2連接比例 （0.5∶1.0，1.0∶1.0，1.5∶1.0）。參照周祥明[7]的方法，用PCR法檢測各連接混合物的重組率（圖5）。取200 bp處特異擴增條帶信號最弱的連接產(chǎn)物 （圖5中的泳道3）用于噬菌體包裝，因為200 bp處信號越弱，說明與載體連接的小片段越少，也即連接效率最好。因此，在本文庫構(gòu)建中采用1.5∶1.0的cDNA∶λTripIEx 2的連接比例。

圖5 ds cDNA與載體連接產(chǎn)物的電泳圖泳道M1：DL2000標(biāo)記；泳道M2：100 bp以上DNA梯度標(biāo)記；1～3：連接混合物；4.對照Figure5 Electrophoresis of ds cDNA ligated with vectorslane M1：DL2000 marker；lane M2：100 bp plus DNA ladder marker；and lanes 1 － 3：mixed，ligated products；4.control

2.4 文庫的質(zhì)量檢測

經(jīng)檢測，未擴增文庫（或初級文庫）的滴度為5.0×105個噬菌斑形成單位（pfu）·mL－1。隨機挑取16個噬菌斑PCR檢測插入片段的大小，結(jié)果顯示cDNA插入片段大小都在500 bp以上，且70.0%左右的片段在1000 bp以上（圖6）。

圖6 未擴增文庫中cDNA插入片段大小的電泳結(jié)果 （部分）泳道M1：λ-EcoT14Ⅰ標(biāo)記 （從下到上標(biāo)記的大小依次為74 bp，421 bp，925 bp，1489 bp，1882 bp，2690 bp，3472 bp，4254 bp，6223 bp，7743 bp，19329 bp）；泳道M2：250 bp DNA梯度標(biāo)記 （從下到上標(biāo)記的大小依次為250 bp，500 bp，750 bp，1000 bp，1500 bp，2250 bp，3000 bp，4500 bp）；泳道 1～16：噬菌斑擴增結(jié)果Figure6 Electrophoresis of cDNA inserts（partial）lane M1：λ-EcoT14Ⅰmarker；lane M2：250 bp DNA ladder marker；and lanes 1－16：amplified cDNA fragments

經(jīng)檢測，擴增文庫的滴度為5.0×109噬菌斑形成單位（pfu）·mL－1。本文庫在將λTripIEx 2轉(zhuǎn)換為pTrip-IEx 2時采用的是大腸桿菌Escherichia coli BM25.8菌株，該菌株不能用藍(lán)白斑篩選的方法判斷重組子，只能用PCR的方法來操作[9]。隨機挑取200個克隆進(jìn)行PCR插入片段大小的檢測，發(fā)現(xiàn)片段大小都在500 bp以上，最大的有2500 bp，平均大小在1000 bp左右，200個克隆中有11個空載，重組率達(dá)94.5%（圖7），大于1000 bp的片段占66.0%左右，質(zhì)量較好。

圖7 擴增文庫中cDNA插入片段大小的電泳檢測（部分）泳道M1：100 bp以上DNA梯度標(biāo)記；泳道M2：DNA標(biāo)記G；泳道1～22：擴增文庫中插入片段大小的隨機檢測Figure7 Electrophoresis of cDNA inserts （partial）lane M1：100 bp plus DNA ladder marker；lane M2：DNA marker G；and lanes 1-22：cDNA inserts

3 討論

傳統(tǒng)的cDNA文庫構(gòu)建方法用oligo（dT）或隨機引物作逆轉(zhuǎn)錄引物合成cDNA，通過酶切削平末端，并連接到適當(dāng)?shù)妮d體[10－11]。SMART（switching mechanism at 5’ end of RNA transcript）技術(shù)是近年發(fā)展起來的一項利用較少mRNA甚至總RNA建立cDNA文庫的方法[12-14]，其主要原理是應(yīng)用5’SMART引物得到全長cDNA，并利用長距離聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（LD-PCR）特異擴增全長cDNA，排除了不完整的cDNA片斷，并通過基因組內(nèi)極其稀有的酶切位點SfiⅠ切割cDNA，得到接頭并定向連接到載體中，大大提高了連接效率。同時，運用LD-PCR對cDNA進(jìn)行合成，使得低豐度的基因表達(dá)序列在文庫中得到了富集，便于稀有mRNA擴增和克隆，從而使庫容量得到了保證。

構(gòu)建高質(zhì)量的cDNA文庫，前提是提取并分離出高質(zhì)量的mRNA，所獲得mRNA越完整，種類越多，構(gòu)建的cDNA文庫就越完整，質(zhì)量就越高。因此，提取純度高、完整性好的mRNA就成為cDNA文庫構(gòu)建的核心步驟，直接關(guān)系到文庫質(zhì)量[15]。植物組織中RNA含量較低。因此，采集山核桃果實后用液氮速凍，并存放于－70℃，以保證RNA不降解；另外，在提取過程中嚴(yán)格防止RNA酶的污染，這是實驗成敗的關(guān)鍵，尤其是幾個mRNA樣品混合時。常用的mRNA的純化方法有oligo（dT）-纖維素柱層析法、 oligo（dT）-纖維素液相離心法、 oligo（dT）-磁珠法[16]。本研究采用 oligo（dT）-磁珠法，分離得到的mRNA質(zhì)量較好，是構(gòu)建高質(zhì)量的cDNA文庫的一個重要因素。

此試劑盒利用長距離聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（LD-PCR）特異擴增全長cDNA，所以控制LD-PCR的循環(huán)數(shù)對于cDNA的合成大小以及基因在文庫中拷貝數(shù)分布很重要[17]，適當(dāng)?shù)难h(huán)次數(shù)可以防止低拷貝數(shù)的基因丟失；同時也可以防止高拷貝數(shù)的基因過分放大，試驗中應(yīng)嚴(yán)格按照mRNA起始量，合理安排PCR循環(huán)數(shù)[18]。本實驗中根據(jù)獲得的mRNA的量（0.055 μg），選用了26個循環(huán)數(shù)，效果較好。

cDNA片段與載體連接之前除去過短的cDNA片段也非常重要，若不能有效地去除短cDNA片段，將會降低文庫平均插入片段長度。本研究采用CHROMA SPIN-400將小于400 bp的片段去除，保證了文庫中具有較大分子的cDNA，減少短片段優(yōu)先連接的機率，提高長片段的連接效率。此外，我們將分級分離后的cDNA片段與載體λTripIEx 2按不同的比例分別進(jìn)行連接，且取連接效率較好的進(jìn)行文庫包裝。有研究表明，將cDNA片段分級分離，去除小片段后再與載體連接可以提高大片段克隆的比例[19]。因此，本研究建立的cDNA文庫插入片段都大于500 bp，平均長度較長，大于1000 bp的片段占66.0%左右，質(zhì)量較好。在文庫插入片段大小檢測方面，周秦等[4]曾就質(zhì)粒雙酶切、質(zhì)粒PCR和含有質(zhì)粒菌液的PCR等3種方法進(jìn)行了比較，3種方法的結(jié)果一致。因此，在研究中可以直接用菌液PCR的方法來檢測插入片段的大小，不用提取質(zhì)粒，方便快捷。

山核桃脂肪代謝相關(guān)cDNA文庫的成功構(gòu)建，為后續(xù)基于cDNA文庫的表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）測序分析及單核苷酸多態(tài)性（SNP）與簡單序列重復(fù)（SSR）標(biāo)記開發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ)。

[1]鄔賢夢，官春云，李栒，等.油菜脂肪酸品質(zhì)改良的研究進(jìn)展[J].作物研究，2003，17（3）：152-158.WU Xianmeng，GUAN Chunyun，LI Xun，et al.Advances in breeding for improved fatty acids in rapeseed [J].Crop Res，2003，17 （3）：152 － 158.

[2]黃堅欽，鄭炳松，黃有軍，等.木本油料植物山核桃新品種的選育[J].生物質(zhì)化學(xué)工程，2006，40（12）：178-181.HUANG Jianqin，ZHENG Bingsong，HUANG Youjun，et al.Selection and breeding of new varieties of the oil-bearing tree hickory （Carya cathayensis Sarg.）[J].Biom Chem Eng，2006，40 （12）：178 － 181.

[3]解紅恩，黃有軍，薛霞銘，等.山核桃果實生長發(fā)育規(guī)律[J].浙江林學(xué)院學(xué)報，2008，25（4）：527-531.XIE Hong’en，HUANG Youjun，XUE Xiaming，et al.Growth and development of the Carya cathayensis nut [J].J Zhejiang For Coll，2008，25 （4）：527 － 531.

[4]周秦.山核桃果實成熟期間基因表達(dá)的初步分析[D].臨安：浙江農(nóng)林大學(xué)，2010.ZHOU Qin.Fruit Ripening-associated Gene Expression in Carya cathayensis [D].Lin’an：Zhejiang A&F University，2010.

[5]周秦，黃有軍，曾燕如，等.山核桃胚和胚乳總RNA的提取與cDNA的合成[J].浙江林業(yè)科技，2009，29（1）：36-39.ZHOU Qin，HUANG Youjun，ZENG Yanru，et al.Isolation of total RNA from embryo and endosperm of hickory nut and synthesis of cDNA [J].J Zhejiang For Sci Technol，2009，29 （1）：36 － 39.

[6]LAURA J，ANNA M P，MINNA H.Isolation of high quality RNA from bilberry （Vaccinium myrtillus L.） fruit[J].Mol Biotechnol，2001，19：201-203.

[7]周祥明.美洲黑楊雄性花芽cDNA文庫構(gòu)建及花發(fā)育相關(guān)基因的克隆與鑒定[D].北京：北京林業(yè)大學(xué)，2007.ZHOU Xiangming.Construction of cDNA Library and Identification of Genes Involved in Floral Development in Male Floral Buds of Populus deltoids [D].Beijing：Beijing Forestry University，2007.

[8]PROMEGA.Technical Manual：PolyATtract? mRNA Isolation Systems [R].Madison：Promega，2009.

[9]CLONTECH.SMARTTM cDNA Library Construction Kit User Manual[R].San Francisco：Clontech，2009.

[10]SUZUKI Y，YOSHITOMO-NAKAGAWA K，MARUYAMA K，et al.Construction and characterization of a fulllength-enriched and a 5’-end-enriched cDNA library [J].Gene，1997，200 （1）：149 － 156.

[11]HEALY V.RT-PCR in cDNA library construction [J].Methods Mol Biol，2002，193 （3）：349 － 361.

[12]WELLENREUTHER R，SCHUPP I，POUSTKA A，et al.The German cDNA consortium SMART amplification combined with cDNA size fractionation in order to obtain large full-length clones [J].BMC Genomics，2004，36 （5）：1－8.

[13]CHENCHIK A，MOQADAM F，SIEBERT P.A new method for full-length cDNA cloning by PCR [M]//KRIEG P A.A Laboratory Guide to RNA Isolation，Analysis and Synthesis.New York：Wiley-Liss，1996：273 － 32l.

[14]SEHULER G D.Pieces of the puzzle：expressed sequence tags and the catalog of human genes [J].J Mol Med，1997，75：694－ 698.

[15]方花，魏小勇.鐵皮石斛cDNA文庫的構(gòu)建及分析[J].生命科學(xué)研究，2005，9（3）：263－266.FANG Hua，WEI Xiaoyong.Construction and analysis of a cDNA expression library of Dendrobium candidum [J].Life Sci Res，2005，9 （3）：263 － 266.

[16]姚知行.分子生物學(xué)技術(shù)講座（三）真核細(xì)胞mRNA的提取，純化，分析及cDNA文庫的構(gòu)建[J].生物學(xué)通報，1997，32 （8）：23-24.YAO Xingzhi.Lecture on molecular biotechnology（three）：extraction，purification，analysis of eukaryotic mRNA and cDNA library construction [J].Bull Biol，1997，32 （8）：23 － 24.

[17]朱金鑫，李小方.酵母雙雜交技術(shù)及其在植物研究中的應(yīng)用[J].植物生理學(xué)通訊，2004，40（2）：235-240.ZHU Jinxin，LI Xiaofang.Yeast two-hybrid technology and its application in the research of plants [J].Plant Physiol Commun，2004，40 （2）：235-240.

[18]方玉楷，許麗艷，麥瑞琴.酵母雙雜交技術(shù)的影響因素及其實驗策略[J].中國實驗診斷學(xué)，2005，9（1）：70-74.FANG Yukai，XU Liyan，MAI Ruiqin.Factors effecting on yeast two hybrid experiments and their responding strategies [J].Chin J Lab Diagn，2005，9 （1）：70 － 74.

[19]WELLENREUTHER R，SCHUPP I，POUSTKA A，et al.The German cDNA consortium SMART amplification combined with cDNA size fractionation in order to obtain large full-length clones [J].BMC Genomics，2004，36 （5）：1－8.