李 丹，張玉潔，汪 霞，應永飛，林仙軍，扎依達，賈新建，薛 毅，仲 鋒

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081;2.浙江省獸藥監(jiān)察所，杭州 310000;3.新疆獸藥飼料監(jiān)察所，烏魯木齊 830063;4.中國動物疫病預防控制中心，北京 100026)

氟苯達唑、噻苯達唑?qū)儆诒讲⑦溥蝾愹?qū)蟲藥，對牛、羊的肝片吸蟲、大片形吸蟲及前后盤吸蟲均有良好的殺滅效果，且毒性較小。因此從1960年開始已經(jīng)廣泛應用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)中［1］。噻苯達唑?qū)Υ蟛糠治改c道線蟲，尤其是成蟲及特定的幼蟲有很好的驅(qū)蟲效果;氟苯達唑?qū)儆诳谷湎x藥，具有廣譜、高效的特點。氟苯達唑和噻苯達唑的廣泛使用在一定程度上對人類造成危害，因此必須采取有效的技術手段，對動物性食品中的有關藥物殘留進行檢測，以確保人類對動物性食品消費的安全。本研究旨在建立一種高效液相色譜法，可同時檢測羊組織(肌肉、肝臟、腎臟、脂肪)、雞組織(肌肉、肝臟)中氟苯達唑、噻苯達唑及代謝物2－氨基氟苯達唑、5－羥基噻苯達唑藥物的殘留。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑 Agilent 1100高效液相色譜儀(配紫外檢測器)，美國安捷倫公司;AE 240型分析天平;Biofuge Stratos高速冷凍離心機，德國賀利氏公司;乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)，美國Fisher公司;碳酸鈉、甲酸、鹽酸、氨水、乙酸銨、異辛烷、正丙醇、無水乙醇(分析純)，北京化工廠;氟苯達唑、2－氨基氟苯達唑、噻苯達唑、5－羥基噻苯達唑?qū)φ掌?，德國Adlershof Gmbh公司，含量均≥99.0%;MCX固相萃取柱(60 mg/3 cc)，Waters公司。

1.2 對照溶液的配制 氟苯達唑、2－氨基氟苯達唑、噻苯達唑和5－羥基噻苯達唑標準儲備液配制(1 mg/mL):稱取氟苯達唑、2－氨基氟苯達唑、噻苯達唑和5－羥基噻苯達唑?qū)φ掌芳s10 mg，精密稱定，于10 mL量瓶中，加甲醇及滴加10%鹽酸溶液溶解后，用甲醇稀釋至刻度，制成濃度為1 mg/mL的標準儲備液，于－20℃以下保存，有效期6個月。

氟苯達唑、2－氨基氟苯達唑、噻苯達唑和5－羥基噻苯達唑標準工作液配制(10 μg/mL):準確量取標準儲備液0.1 mL，于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋成氟苯達唑、2－氨基氟苯達唑、噻苯達唑和5－羥基噻苯達唑10 μg/mL標準工作液。2～8℃保存，有效期1個月。

1.3 色譜條件 流動相 A相為0.02 mol/L乙酸銨溶液，B相為乙腈，梯度洗脫程序如表1所示。

色譜柱 Hypersil C18，250 mm ×4.6 mm(i.d)，粒徑 5 μm，或相當者;檢測波長 306 nm;柱溫40 ℃;進樣量 20 μL。

表1 流動相梯度洗脫表

1.4 組織樣品的提取與凈化 稱取(2±0.05)g試料，于50 mL離心管中，加2%碳酸鈉溶液0.5 mL、乙腈8 mL、異辛烷5 mL，渦旋混勻，中速振蕩5 min，5000 r/min離心5 min，取下層清液于50 mL雞心瓶中。殘渣再加2%碳酸鈉溶液0.5 mL、乙腈8 mL重復提取一次，合并兩次下層清液，加正丙醇5 mL。于50℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入30%鹽酸乙醇溶液8 mL，渦旋混勻后備用。

依次用甲醇3 mL、2%甲酸水溶液3 mL，活化MCX固相萃取柱。將備用液過柱。依次用2%甲酸水溶液3 mL、甲醇3 mL淋洗，抽干。用5%氨化甲醇溶液3 mL洗脫。洗脫液于50℃水浴下用氮氣吹干。用流動相1.0 mL(0.02 mol/L乙酸銨溶液∶乙腈=85∶15)溶解，混勻。過濾膜后作為試料溶液，供高效液相色譜分析。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的選擇 參考國內(nèi)外有關資料，并對氟苯達唑、2－氨基氟苯達唑、噻苯達唑和5－羥基噻苯達唑進行紫外掃描，考慮要同時檢測四種藥物，最終確立其檢測波長為306 nm。

2.2 標準曲線及線性范圍 準確量取適量氟苯達唑、2－氨基氟苯達唑、噻苯達唑、5－羥基噻苯達唑標準工作液，用流動相稀釋成濃度分別為0.02、0.04、0.1、0.2、0.3、0.6、1.5 μg/mL 的系列混合標準溶液，將此系列混合標準溶液，依次從低濃度到高濃度按液相色譜條件進行分析，每一濃度進樣三次，按其所得三次峰面積的平均值與對應的對照溶液的質(zhì)量濃度做標準曲線，并計算回歸方程及相關系數(shù)(表2)。

表2 氟苯達唑、2－氨基氟苯達唑、噻苯達唑和5－羥基噻苯達唑標準曲線

2.3 樣品提取 國內(nèi)外關于測定羊、雞組織中氟苯達唑、2－氨基氟苯達唑、噻苯達唑和5－羥基噻苯達唑藥物殘留的報道，有液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜、高效液相色譜、熒光檢測及紫外檢測等方法，但檢測波長均有不同。藥物殘留提取方法的手段也均不相同，有液－液提取、液－固提取等。參考國內(nèi)外的文獻，實驗最初采用液 －固提取的方法，使用 C18、HLB、MAX、MCX、硅膠等固相萃取柱，采用的提取液有不同濃度的無機鹽溶液及直接用有機溶液提取，經(jīng)過多次試驗反復摸索，最終采用液－固提取，用乙腈作為提取液，從羊、雞組織中提取藥物殘留。

在方法研究過程中，分別用甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯等有機溶劑作為提取液，再加入少量的酸、堿溶液，以便更有利于藥物殘留的提取。經(jīng)過試驗摸索用乙腈提取，其回收率較為理想。

在提取實驗中，分別在提取液中加入少量的酸、堿溶液。其結果是加入少量的堿溶液比加酸溶液，其效果更為明顯。在兩次提取時均要加堿，如果僅加一次堿，其回收率明顯降低。經(jīng)過多次試驗反復摸索，在用乙腈作為提取液的同時，加入0.5 mL的碳酸鈉溶液，提高了提取效率。同時對1%、2%、3%、5%四種不同濃度的碳酸鈉溶液進行了考察，實驗結果顯示，加入2%碳酸鈉溶液時提取效率是最高的。因此，最終確立加入碳酸鈉溶液的濃度是2%。

在提取脫脂過程中，分別用異辛烷、正己烷等作為脫脂溶劑進行了試驗，實驗結果顯示用異辛烷明顯要好于正己烷，因此選用異辛烷作為脫脂溶劑。

通過上述樣品提取方法和色譜條件，空白溶液、標準溶液和試樣溶液的高效液相色譜圖分別如圖1、圖2、圖3所示。

2.4 方法準確度和精密度 采用標準添加法，選取3種不同濃度，藥物在羊肝、腎、肌肉、脂肪四種組織的最高殘留限量均為100 μg/kg，選取的三種濃度為20、100、200 μg/kg。藥物在雞肌肉中的最高殘留限量為 200 μg/kg，選取的三種濃度為 20、200、400 μg/kg。藥物在雞肝臟中的最高殘留限量為500 μg/kg，選取的三種濃度為 20、500、800 μg/kg。選取的三種濃度基本包含了上述藥物進行殘留檢測的要求，其中靈敏度為20 μg/kg的濃度點為定量限。每種濃度5個樣品，重復3批次，求回收率，批內(nèi)、批間變異系數(shù)。測定結果如表3～表6所示。

表3 羊腎、羊肝中氟苯達唑、2－氨基氟苯達唑、噻苯達唑和5－羥基噻苯達唑回收率測定結果

(續(xù)表)

表4 羊肉、羊脂肪中氟苯達唑、2－氨基氟苯達唑、噻苯達唑和5－羥基噻苯達唑回收率測定結果

(續(xù)表)

從上述表中數(shù)據(jù)可以看出，無論是各種添加濃度的回收率，還是批內(nèi)、批間的變異系數(shù)均符合農(nóng)業(yè)部農(nóng)發(fā)［2003］1號關于發(fā)布《獸藥殘留試驗技術規(guī)范(試行)》通知中規(guī)定的要求。此方法提取過程簡單，操作步驟少，所用化學試劑的量也少，減少了對環(huán)境的污染。此方法適用于羊、雞組織中上述藥物殘留的檢測。

表6 雞肝中氟苯達唑、2－氨基氟苯達唑、噻苯達唑和5－羥基噻苯達唑回收率測定結果

［1］陳杖榴.獸醫(yī)藥理學［M］.第2版.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2002:282.