李 娜，王 涵，文 威，周岐新

(重慶醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，重慶 400016)

抑郁癥是一種以明顯持久的情緒低落或心境改變?yōu)橹饕卣鞯木裾系K。具有高發(fā)病率、高自殺率和高疾病負(fù)擔(dān)，已成為全球關(guān)注的疾病。然而，其確切發(fā)病機(jī)制至今未完全明了。近年來發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激和自由基增加在神經(jīng)精神疾病發(fā)病過程中可能起著重要作用［1］。體內(nèi)自由基誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)生成丙二醛(melondialdehyde，MDA)，后者對(duì)機(jī)體組織細(xì)胞造成嚴(yán)重?fù)p傷。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)與過氧化氫酶(catalase，CAT)是腦內(nèi)重要清除自由基的抗氧化酶類，能保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受自由基損傷。因此，機(jī)體氧化/抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)平衡可能涉及抑郁癥發(fā)生、發(fā)展和緩解的過程。目前臨床治療抑郁癥的藥物主要包括5-HT再攝取抑制劑、去甲腎上腺素再攝取抑制劑和三環(huán)類抗抑郁藥;它們的作用原理一般認(rèn)為與抑制神經(jīng)突觸前膜5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)體(5-HT transporter，5-HTT)和去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)體(norepinephrine transporter，NET)，使突觸間隙內(nèi)5-HT和NE水平升高有關(guān)。然而Jiang等［2］證明，5-HTT基因敲除小鼠顯示抑郁行為，這似乎與上述藥物抗抑郁原理相矛盾。為此，我們采用慢性輕度不可預(yù)見性刺激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)建立大鼠抑郁模型，研究了選擇性NE重?cái)z取抑制劑瑞波西汀的給予對(duì)大鼠抑郁行為的影響及其與氧化/抗氧化應(yīng)激平衡和腦橋NET和海馬5-HTT表達(dá)關(guān)系。希望對(duì)抑郁癥的發(fā)生機(jī)制和瑞波西汀的抗抑郁作用有新的認(rèn)識(shí)和了解。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物清潔級(jí)♂Sprague-Dawley(SD)大鼠60只，180～220 g，重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，醫(yī)學(xué)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(渝)2007-0001。

1.1.2主要試劑與儀器MDA測(cè)定試劑盒、SOD測(cè)定試劑盒、CAT測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所，A003，A001，A007);甲磺酸瑞波西汀(重慶藥友制藥有限責(zé)任公司，原料藥，純度＞98%);PCR引物(上海鼎安生物技術(shù)有限公司);RNA store組織保存液、TRIzol總RNA提取試劑、TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒、2×Taq PCR MasterMix試劑盒 (TIANGEN 公 司，J8414，DP405，KR104，KT201);PCR儀(PTC200型，Bio-rad公司)。

1.1.3藥物配制稱取適量甲磺酸瑞波西汀，以5 g·L-1CMC-Na溶液配制成0.1 g·L-1混懸液，4℃保存。

1.2方法

1.2.1分組與給藥♂ SD大鼠60只，自由攝食飲水，室溫(20±3)℃，正常光照節(jié)律為 8:00～20:00，安靜通風(fēng)的實(shí)驗(yàn)環(huán)境適應(yīng)3 d后，采用openfield法篩選大鼠，選取水平活動(dòng)得分30～120之間的大鼠，隨機(jī)分為4組，即正常對(duì)照組(NG)、模型組(MG)、瑞波西汀處理的模型組(RMG)和正常組(RNG)。每組15只，NG組和RNG組5只/籠，正常對(duì)照組大鼠自由攝食飲水，正常光照節(jié)律，MG組和RMG組采取孤養(yǎng)結(jié)合CUMS方式建模。每天上午刺激前1 h灌胃，瑞波西汀給予劑量為0.7 mg·kg-1·d-1，MG組和 NG組給予等體積5 g·L-1CMC-Na溶劑。

1.2.2孤養(yǎng)結(jié)合CUMS方式制備動(dòng)物模型參照Willner等［3］方法并加以改進(jìn)，建立實(shí)驗(yàn)性抑郁動(dòng)物模型。刺激方式包括禁食24 h，禁水24 h，通宵照明，間歇照明(光/暗周期為2h/2h，時(shí)間20:00～8:00)，潮濕墊料18h，傾斜鼠籠45°24 h，4℃冰水游泳5 min，45℃熱水浴5 min，夾尾1 min，水平震蕩3 min，共10種刺激，每天隨機(jī)安排給予1種刺激，每種出現(xiàn)2～3次，同種刺激不連續(xù)出現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)周期為28 d。d 29，開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)。d 30，糖水消耗實(shí)驗(yàn)。

1.2.3行為學(xué)檢查

1.2.3.1開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(open-field)參照文獻(xiàn)［4］，使用自制100 cm×100 cm×40 cm木箱，底部平均分為4×4個(gè)方格，木箱內(nèi)全部漆成黑色。保持環(huán)境安靜，將大鼠置于木箱中央，通過攝像系統(tǒng)和電腦視頻系統(tǒng)連接，在計(jì)算機(jī)上觀察大鼠5 min內(nèi)的活動(dòng)情況，記錄大鼠的水平得分(四爪均進(jìn)入方格的穿越格數(shù))、垂直得分(后肢直立次數(shù))和理毛次數(shù)。

1.2.3.2糖水消耗實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)［3］，于建模完成前訓(xùn)練大鼠試飲10 g·L-1蔗糖水24 h，隨后飲純水24 h，訓(xùn)練期間正常進(jìn)食。訓(xùn)練結(jié)束開始實(shí)驗(yàn):禁食禁水24 h后大鼠單籠放置，同時(shí)給予蔗糖水和純水各1瓶。1 h后記錄蔗糖水消耗量和純水消耗量，并計(jì)算糖水偏好率(糖水消耗/總液體消耗×100%)。

1.2.4血清MDA含量和SOD、CAT活力測(cè)定建模完成后，每組取6只大鼠，斷頭取血，靜置30 min后3 000 r·min-1離心10 min，分離血清-80℃保存。MDA含量和SOD及CAT活力測(cè)定按試劑盒說明書規(guī)范進(jìn)行。

1.2.5海馬病理形態(tài)學(xué)觀察造模結(jié)束，每組取3只大鼠40 g·L-1水合氯醛(400 mg·kg-1，ip)麻醉，仰臥固定，經(jīng)左心室注入生理鹽水100 ml，剪碎肝臟作為血液和灌注液出口，再注入40 g·L-1多聚甲醛磷酸鹽緩沖液200 ml固定組織。取腦組織，剝離雙側(cè)海馬，40 g·L-1多聚甲醛浸泡過夜，腦組織冠狀切片，切片厚約4 μm，常規(guī)HE染色觀察海馬病理改變。

1.2.6腦橋NET和海馬5-HTT mRNA表達(dá)測(cè)定

1.2.6.1取材 造模結(jié)束，每組取3只大鼠40 g·L-1水合氯醛(400 mg·kg-1，ip)麻醉，斷頭取腦組織，分離腦橋和海馬，置于裝有RNA store組織保存液(每100 mg組織加入1 ml RNA store)的EP管，4℃過夜，移出液體，組織于-80℃保存。

1.2.6.2引物設(shè)計(jì) 由公司設(shè)計(jì)合成。引物序列及擴(kuò)增片段大小見Tab 1。

Tab 1 Primer sequence and product size of NET and 5-HTT gene

1.2.6.3RT-PCR檢測(cè)NET和5-HTT表達(dá) 以TRIzol法按試劑盒說明書提取腦橋和海馬樣本總RNA;取 1 μg總 RNA，用 TIANScript cDNA 第一鏈合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，反應(yīng)條件:42℃30min→ 99℃ 5 min→ 4℃ 5 min→ 短時(shí)離心后-20℃保存。PCR擴(kuò)增分別采用NET、5-HTT和βactin引物，擴(kuò)增條件:94℃ 5 min解鏈→94℃ 30 s變性→60℃ 30 s退火→72℃延伸1 min(擴(kuò)增循環(huán)NET 33次，5-HTT 31次，β-actin 28次)72℃充分 延伸5min。取15 μl RT-PCR產(chǎn)物，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，凝膠數(shù)字掃描成像系統(tǒng)照相并測(cè)定條帶積分吸光度，以待檢基因條帶與內(nèi)參條帶吸光度比值作為目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示，用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1瑞波西汀對(duì)CUMS致大鼠抑郁行為的影響

2.1.1開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(open-field)CUMS致大鼠(MG組)活動(dòng)的水平得分、垂直得分和理毛次數(shù)都明顯低于NG組，瑞波西汀預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)這種改變，瑞波西汀預(yù)處理對(duì)未接受CUMS刺激的正常大鼠活動(dòng)無影響(Tab 2)。

Tab 2 Results of the rat behaviors observed in the open-field test(±s，n=9～15)

Tab 2 Results of the rat behaviors observed in the open-field test(±s，n=9～15)

＊＊P＜0.01，*P＜0.05 vs corresponding value of NG;#P＜0.05，##P ＜0.01 vs corresponding value of MG.NG:normal group;MG:model group;RMG:reboxetine(0.7 mg·kg-1·d-1)-treated model group;RNG:reboxetine(0.7 mg·kg-1·d-1)-treated normal group.

Group Crossing Rearing Preening NG 68.5±23.3 20.1±10.4 5.3±2.8 MG 22.8±20.2＊＊ 6.9±5.9＊＊ 2.5±2.1*RMG 54.3±24.1## 15.2±7.2## 5.1±2.3#RNG 63.2±14.3 19.2±7.6 3.9±1.7

2.1.2糖水消耗實(shí)驗(yàn)與正常對(duì)照組［(81.2±16.1)%］相比，模型組［(35.8±33.6)%］大鼠糖水偏好率下降(P＜0.01);瑞波西汀預(yù)處理的模型組［(62.2±17.4)%］大鼠糖水偏好率較模型組升高(P＜0.01);瑞波西汀預(yù)處理的正常組［(76.0±9.6)%］大鼠糖水偏好率與正常對(duì)照組無差異。結(jié)合開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說明瑞波西汀能明顯改善CUMS誘導(dǎo)的大鼠抑郁行為。

2.2瑞波西汀對(duì)大鼠血清MDA水平和SOD及CAT活力影響與NG組比，MG組大鼠血清MDA水平明顯升高(P＜0.01)，SOD、CAT活力下降(P＜0.01);瑞波西汀預(yù)處理能逆轉(zhuǎn)這種變化;瑞波西汀預(yù)處理對(duì)正常大鼠血清MDA水平以及SOD、CAT活力均無影響(Tab 3)。

Tab 3 Concentration of MDA and the activities of SOD and CAT in serum of rats(xˉ±s，n=6)

2.3瑞波西汀對(duì)海馬病理形態(tài)學(xué)變化的影響NG組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞呈圓形，結(jié)構(gòu)清晰完整。與NG組相比，MG組海馬齒狀回、CA1、CA2和CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度的核固縮和染色加深，細(xì)胞呈不規(guī)則多邊形或梭形，細(xì)胞數(shù)目明顯減少。瑞波西汀預(yù)處理明顯減輕CUMS引起的海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷，瑞波西汀預(yù)處理對(duì)正常大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)無影響(Fig 1)。

Fig 1 Hippocampal histopathology(HE，×100 and ×400)

2.4瑞波西汀對(duì)腦橋NET與海馬5-HTT mRNA表達(dá)影響與NG組相比，MG組大鼠腦橋NET和海馬5-HTT mRNA表達(dá)均明顯降低(P＜0.01)。瑞波西汀預(yù)處理阻遏CUMS引起的大鼠NET與5-HTT mRNA表達(dá)(P＜0.01)降低，瑞波西汀預(yù)處理對(duì)正常大鼠NET與5-HTT mRNA表達(dá)無影響(Fig 2，Tab 4)。

Fig 2 Expressions of NET mRNA in pons cerebelli and 5-HTT mRNA in hippocampus of rats

Tab 4 Expressions of NET mRNA in pons cerebelli and 5-HTT mRNA in hippocampus of rats(±s，n=3)

Tab 4 Expressions of NET mRNA in pons cerebelli and 5-HTT mRNA in hippocampus of rats(±s，n=3)

＊＊P＜0.01 vs corresponding value of NG;##P＜0.01 vs corresponding value of MG.NG:normal group;MG:model group;RMG:reboxetine(0.7 mg·kg-1·d-1)-treated model group;RNG:reboxetine(0.7 mg·kg-1·d-1)-treated normal group.

Group NET/β-actin 5-HTT/β-actin NG 1.37±0.09 0.44±0.01 MG 0.61±0.05＊＊ 0.26±0.01＊＊RMG 1.37±0.05## 0.52±0.05##RNG 1.34±0.08 0.48±0.04

3 討論

CUMS模擬抑郁癥的環(huán)境誘因，誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物形成的抑郁癥核心癥狀能被經(jīng)典的抗抑郁藥物改善。因此該模型常用于抑郁癥的病理生理機(jī)制和抗抑郁藥物作用機(jī)制的研究［5］。本研究采用 CUMS建立大鼠抑郁模型，觀察瑞波西汀干預(yù)對(duì)抑郁行為的影響與氧化/抗氧化應(yīng)激平衡以及與特定情感活動(dòng)密切相關(guān)腦區(qū)NET和5-HTT基因表達(dá)的關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CUMS致大鼠出現(xiàn)抑郁行為，同時(shí)顯示血MDA水平升高和SOD及CAT活性降低，海馬神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)明顯病理形態(tài)學(xué)損傷，提示抑郁癥大鼠體內(nèi)出現(xiàn)氧化/抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)失衡，氧化應(yīng)激的增強(qiáng)損傷了脆弱的海馬神經(jīng)細(xì)胞。相當(dāng)于臨床病人用量的瑞波西汀給予明顯改善CUMS所致大鼠抑郁癥狀，阻遏MDA升高和SOD及CAT活性降低，減輕了海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷。類似的氧化/抗氧化應(yīng)激失衡可見于相關(guān)的臨床抑郁癥病例報(bào)道，但抗抑郁藥治療未觀察到氧化/抗氧化應(yīng)激平衡的改變［6-7］。這種動(dòng)物模型與臨床病人對(duì)抗抑郁藥反應(yīng)的差異提示臨床抑郁癥病因的復(fù)雜性。陳紅霞等［8］也報(bào)道慢性應(yīng)激可致海馬CA1、CA3和齒狀回神經(jīng)元以及CA1區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞形狀改變和數(shù)目減少。

眾所周知，腦橋藍(lán)斑核NE和海馬5-HT神經(jīng)元與情感障礙性疾病發(fā)病密切相關(guān)。因此，本課題研究了CUMS致抑郁大鼠腦橋NET和海馬5-HTT基因表達(dá)變化及NET抑制劑瑞波西汀給予的影響。結(jié)果顯示，CUMS誘導(dǎo)抑郁行為致大鼠腦橋NET和海馬5-HTT mRNA表達(dá)均明顯降低，瑞波西汀給予不僅逆轉(zhuǎn)了NET mRNA表達(dá)降低，也逆轉(zhuǎn)了海馬5-HTT mRNA低表達(dá)。結(jié)果提示，抑郁癥發(fā)生可能與NET和5-HTT基因呈低表達(dá)狀態(tài)有關(guān)，而經(jīng)典的抗抑郁藥的治療作用機(jī)制可能并非完全在于抑制NE和5-HTT轉(zhuǎn)運(yùn)體，而是提升其表達(dá)。本研究小組的另一實(shí)驗(yàn)也顯示，5-HTT專一抑制劑帕羅西汀也對(duì)抑郁癥大鼠的NET和5-HTT基因表達(dá)均有明顯提升作用(未發(fā)表的資料)。上述研究結(jié)果增強(qiáng)了我們對(duì)經(jīng)典抗抑郁藥的作用可能與提升NET和5-HTT基因表達(dá)有關(guān)的信念。

本研究結(jié)果還揭示，未經(jīng)受CUMS刺激大鼠接受治療量(7 mg·kg-1·d-1)的瑞波西汀灌胃給予，其行為、體內(nèi)氧化/抗氧化指標(biāo)、NET和5-HTT基因表達(dá)均無明顯影響。提示瑞波西汀抗抑郁作用有針對(duì)性。但 Zhao 等［9］報(bào)道，瑞波西汀(20 mg·kg-1·d-1)給予，連續(xù)40 d，使腦橋藍(lán)斑核NET表達(dá)明顯降低，縫際核5-HTT表達(dá)明顯升高。此種差異可能與其實(shí)驗(yàn)的劑量過大和時(shí)間過長有關(guān)。

總之，本研究結(jié)果提示瑞波西汀的抗抑郁作用除與普遍認(rèn)可的特異性NE重涉取抑制有關(guān)外，至少涉及改善機(jī)體氧化/抗氧化應(yīng)激平衡和提升NET及5-HTT基因表達(dá)有關(guān)。

［1］Herken H，Gurel A，Selek S，et al.Adenosine deaminase，nitric oxide，superoxide dismutase，and xanthine oxidase in patients with major depression:impact of antidepressant treatment［J］.Arch Med Res，2007，38(2):247-52.

［2］Jiang X，Wang J，Luo T，et al.Impaired hypothalamic-pituitaryadrenal axis and its feedback regulation in serotonin transporter knockout mice［J］.Psychoneuroendocrinol，2009，34:317-31.

［3］Willner P，Towell A，Sampson D，et al.Reduction of sucrose preference by chronic unpredictable mild stress，and its restoration by a tricyclic antidepressant［J］.Psychopharmacol(Berl)，1987，93(3):358-64.

［4］Katz R J，Roth K A，Carroll B J.Acute and chronic stress effects open-field activity in the rat:Implications for a model of depression［J］.Neurosci Biobehav Rev，1981，5(2):247-51.

［5］Mcarthur R，Borsini F.Animal models of depression in drug discovery:a historical perspective［J］.Pharmacol Biochem Behave，2006，84(3):436-52.

［6］Gatecki P，Szemraj J，Bienkiewicz M，et al.Lipid peroxidation and antioxidant protection in patients during acute depressive episodes and in remission after fluoxetine treatment［J］.Pharmacol Report，2009，61:436-47.

［7］Sarandol A，Sarandol E，Eker S，et al.Major depressive disorder is accompanied with oxidative stress:short-term antidepressant treatment does not alter oxidative-antioxidative system［J］.Hum Psychopharmacol，2007，22:67-73.

［8］陳紅霞，張黎明，張有志，等.胍丁胺對(duì)慢性應(yīng)激大鼠海馬神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2009，25(1):21-5.

［8］Chen H X，Zhang L M，Zhang Y Z，et al.Effect of agmatine on the neurons and astrocytes in hippocampus of chronically stressed rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(1):21-5.

［9］Zhao Z，Zhang H T，Bootzin E，et al.Association of changes in norepinephrine and serotinin transporter expressions with long-term behavior effects of antidepressant drugs［J］.Neuropsychopharmacol，2009，34:1467-81.