楊 威，應(yīng) 軍，肖百全，黃遠鏗，歐慧瑜，梁惠嬋

(廣州醫(yī)藥工業(yè)研究院，廣東廣州 510240)

糖皮質(zhì)激素是治療內(nèi)科許多疾病的常用藥物之一，但長期、大劑量使用糖皮質(zhì)激素可引起各種嚴(yán)重的不良反應(yīng)和并發(fā)癥。為了臨床正確而合理的使用糖皮質(zhì)激素，目前常以中藥與糖皮質(zhì)激素聯(lián)合應(yīng)用減輕其各種不良反應(yīng)，因此進行相應(yīng)實驗病理模型的建立就顯得尤為重要。有關(guān)糖皮質(zhì)激素的實驗病理模型主要有:垂體—下丘腦——腎上腺—胸腺(HPAT)軸功能受抑模型［1］、糖皮質(zhì)激素致免疫力低下模型［2］、糖皮質(zhì)激素致骨質(zhì)疏松模型［3］，而對糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致的胃腸道功能紊亂的疾病模型及其作用機制卻鮮有報導(dǎo)。本文通過不同給藥途徑和劑量的地塞米松(dexamethasone，DM)對大鼠胃分泌功能及小鼠胃腸運動功能的實驗研究，建立胃腸道功能紊亂的模型及藥物治療后的可逆性改變，為防治糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致的胃腸道不良反應(yīng)提供參考。

1 儀器與材料

SD大鼠(SPF級，體質(zhì)量180～220 g，♂♀各半，合格證號:0022747)，NIH小鼠(SPF級，體質(zhì)量:18～22 g，♂♀各半，合格證號:0022586)，動物均購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證:SCXK(粵):2003-0002。

地塞米松片(廣東華南藥業(yè)有限公司，批號:051201，規(guī)格:0.75 mg/片);地塞米松注射液(天津藥業(yè)集團新鄭股份有限公司，批號:0602212，規(guī)格:5 mg/1 ml/支);阿利新藍(Serva產(chǎn)品，廣州市博理生物科技有限公司分裝);胃蛋白酶試劑盒(南京建成生物工程研究所);葡聚糖藍-2000(批號:17-0360-01;規(guī)格:10g/瓶;Amersham Biosciences 公司);知柏地黃丸:河南省宛西制藥股份有限公司，批號:060207;三九胃泰顆粒，三九醫(yī)藥股份有限公司，批號0604132H。

電子天平(BS400S-WEI，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);可見-紫外分光光度計(TU-1901，北京普析通用公司);電子天平(BS224S，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);恒溫水浴箱(HH.W21.CU600，上海醫(yī)療器械七廠);數(shù)字pH計(PHS-2F，上海精密學(xué)儀器有限公司)。

2 方法

2.1地塞米松致小鼠胃腸道功能紊亂模型胃排空、腸推進的影響昆明種小鼠50只，隨機分為5組，對照組，ig 0.5 mg·kg-1地塞米松劑量組、ig 1.0 mg·kg-1地塞米松劑量組、sc 0.5 mg·kg-1地塞米松劑量組、sc 1.0 mg·kg-1地塞米松劑量組，造模5 d。末次給藥前動物禁食24 h，給藥1 h后，每鼠灌胃 20 g·L-1的葡聚糖藍 -2000 0.4 ml，20 min后脫頸處死動物，剖腹取全胃腸，自幽門括約肌處取胃，沿胃大彎側(cè)剪開，用4 ml去離子水中將胃內(nèi)色素殘留物充分洗滌，以3 500r·min-1離心15 min，取上清液，用紫外分光光度計在波長620 nm測吸光度以此反映胃內(nèi)殘留色素殘留量。以正常對照組均值為100%，其余各組均值與空白對照組之百分比為相對胃內(nèi)色素殘留率。同時迅速剪取小腸，量取幽門括約肌至色素最前沿的距離作為色素在小腸內(nèi)推進距離;從幽門括約肌至回盲部的總長度作為“小腸總長度”，以兩者之比計算出小腸推進率(%)。

2.2地塞米松致大鼠胃腸道功能紊亂模型胃分泌功能的影響SD大鼠50只，隨機均衡分為5組，對照組、ig 0.6 mg·kg-1地塞米松劑量組、ig 1.20 mg·kg-1地塞米松劑量組、sc 0.45 mg·kg-1地塞米松劑量組、sc 0.9 mg·kg-1地塞米松劑量組。連續(xù)給藥8 d，于末次給藥前隔離，禁食不禁水24 h，d 8行幽門結(jié)扎手術(shù)，sc組結(jié)扎幽門前皮下注射給藥，ig組采用十二指腸給藥。術(shù)后6 h，處死動物，結(jié)扎賁門，取胃，量取胃液體積。然后觀察胃黏膜有無充血、潰瘍等癥狀，再測胃壁結(jié)合黏液量。胃液以1 500 r·min-1離心10 min，取上清液，先用酸度計測胃內(nèi)容物pH值，再取1 ml與0.5 ml胃液分別測胃總酸、胃蛋白酶。

2.3知柏地黃丸和三九胃泰對地塞米松抑制小鼠胃腸道運動的影響48只小鼠，♀、♂各半，20～22g，隨機分為4組:空白對照組、地塞米松模型組、知柏地黃丸組(3.75 g·kg-1)、三九胃泰組(15.0 g·kg-1)。各組給藥0.5 h 后灌胃給予地塞米松混懸液1.0mg·kg-1(空白組給予等量的1.0%CMC-Na)，連續(xù)給藥5 d后小鼠禁食24 h，末次給藥及給予地塞米松1 h(空白組除外)后，灌胃給予2%葡聚糖藍0.4 ml/只，20 min后處死動物，迅速剖腹取胃，沿胃大彎側(cè)剪開，用4 ml去離子水將胃內(nèi)容物充分洗出，離心取上清液，用紫外分光光度計在波長620 nm測吸光度，測算胃內(nèi)色素(葡聚糖藍-2000)殘留量(以空白對照組均值為100%，其余各組均值與空白對照組均值之百分比為相對胃內(nèi)色素殘留率)。同時迅速剪取小腸，自然拉直，量取幽門括約肌至色素最前沿的距離作為色素在小腸內(nèi)推進距離;從幽門括約肌至回盲部的總長度作為小腸總長度，計算小腸推進率(%)。

2.4知柏地黃丸和三九胃泰對地塞米松引起的大鼠胃液、胃蛋白酶和胃酸、胃壁結(jié)合黏液量改變的影響SD大鼠46只，♀、♂各半，150～180 g，按體重隨機分為4組:空白對照組、地塞米松模型組、知柏地黃丸組(2.40 g·kg-1)、三九胃泰組(10.0 g·kg-1)。各給藥組給藥0.5 h后灌胃給予地塞米松混懸液(1.2 mg·kg-1)(空白組給予等量的 1.0%CMC-Na)，連續(xù)7 d，動物禁食24h后麻醉動物，開腹結(jié)扎幽門后，立即由十二指腸再給藥1次，然后縫合腹壁。術(shù)后6 h，處死動物，開腹結(jié)扎賁門，摘取全胃，量取胃液體積。用數(shù)字pH計測胃內(nèi)容物pH值后，離心取上清胃液，檢測胃蛋白酶活力［4］，方法參照胃蛋白酶活力測試盒說明書。另取出鼠胃，濾紙吸干表面水分，沿胃大彎剪開鼠胃，將胃黏膜外翻，用生理鹽水清洗2次，再將胃浸泡于30 ml阿利新藍溶液中，于25℃溫化孵育2 h后取出鼠胃，反應(yīng)液離心后取上清液于分光光度計615 nm波長處比色測定吸光度，按公式:6×(1-實測光密度/標(biāo)準(zhǔn)管光密度)，計算每只鼠胃壁黏液結(jié)合黏液量。

2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)處理用單因素方差分析法(ANOVA)，數(shù)據(jù)表示為±s。所有數(shù)據(jù)間的差異顯著性分析用SPSS 1110軟件中Dunnett'st檢驗進行處理。

3 結(jié)果

3.1地塞米松對小鼠胃排空、腸推進的影響結(jié)果表明(見Tab 1)，與正常組比較，灌胃及皮下注射地塞米松均能不同程度地降低小鼠的小腸推進率(P＜0.01或0.05)，增加胃內(nèi)相對色素殘留率(P＜0.01或0.05)，并有一定的量效關(guān)系。以上結(jié)果表明地塞米松有減緩胃腸道運動的作用，并以地塞米松灌胃1.0 mg·kg-1組的作用明顯。

Tab 1 Effect of dexamethasone on intestinal motility and gastric emptying of mice(±s，n=10)

Tab 1 Effect of dexamethasone on intestinal motility and gastric emptying of mice(±s，n=10)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs normal

Group Dose/mg·kg-1 Small intestinal propulsion rate/%Relative residue rate of intragastric dye/%Normal - 61.3 ±13.9 100.00 ±28.75 DM(ig)0.5 43.3 ±11.3* 167.34 ±97.40＊＊DM(ig)1.0 38.5 ±11.0＊＊ 209.22 ±68.85＊＊DM(sc)0.5 49.7 ±6.3* 164.67 ±54.43＊＊DM(sc)1.0 52.3 ±7.1 168.73 ±44.21＊＊

3.2地塞米松對大鼠胃分泌功能及胃黏膜的影響

3.2.1地塞米松對大鼠胃液量、胃液pH值、胃總酸濃度、胃總酸分泌量的影響結(jié)果(Tab 2)表明:與正常組比較，地塞米松給藥8 d后各劑量組的胃液量增加，胃液pH值減小，總酸度增加，總酸分泌量增加，其中地塞米松灌胃1.2 mg·kg-1組的胃酸的影響最為明顯(P＜0.05或0.01)。

3.2.2地塞米松對大鼠胃蛋白酶及胃壁結(jié)合黏液量的影響結(jié)果(Tab 3)表明:與正常組比較，灌胃地塞米松1.2 mg·kg-1組的胃蛋白酶明顯增加(P＜0.01)，皮下注射地塞米松0.90 mg·kg-1組胃蛋白酶亦有增加的趨勢(P＞0.05);與正常組比較，地塞米松各劑量除灌胃0.45 mg·kg-1組外，其余各組均能降低胃壁結(jié)合黏液量(P＜0.05)，從而增加了對胃黏膜屏障的損傷;其中地塞米松灌胃1.2 mg·kg-1組對大鼠胃蛋白酶及胃壁結(jié)合黏液量的影響最為明顯。

3.2.3動物解剖肉眼觀察結(jié)果動物處死后取胃解剖后肉眼觀察結(jié)果表明與正常組比較，模型組不同程度的出現(xiàn)腸管外壁充血、胃壁充血、胃黏膜充血、胃潰瘍的現(xiàn)象(Tab 4)，其中以ig組引起的胃腸道病變癥狀比sc組更為嚴(yán)重，ig組又以1.2 mg·kg-1組病變最明顯，達100%。

Tab 2 Effect of dexamethasone on gastric acid of rats(±s，n=10)

Tab 2 Effect of dexamethasone on gastric acid of rats(±s，n=10)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs normal

Group Dose/mg·kg-1 Volume of gastric juice/ml pH value of gastric juice Total acidity/mol·L-1 Total acid secretion/mmol·(6 h)-1 Normal - 3.5 ±1.19 2.1 ±0.71 0.098 ±0.008 0.347 0.107 ±0.286 0.486 ±0.286±0.143 DM(ig)0.60 4.3 ±2.1 1.5 ±0.13＊＊ 0.110 ±0.012* 0.506 ±0.286*DM(ig)1.20 5.3 ±2.34* 1.4 ±0.20＊＊ 0.110 ±0.019* 0.613 ±0.331*DM(sc)0.45 4.1 ±1.66 1.6 ±0.28* 0.095 ±0.023 0.409 ±0.213 DM(sc)0.90 4.4 ±2.10 1.6 ±0.40*

Tab 3 Effect of dexamethasone on gastric pepsin activity of rats(±s，n=10)

Tab 3 Effect of dexamethasone on gastric pepsin activity of rats(±s，n=10)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs normal

Group Dose/mg·kg-1 Gastric pepsin activity/U Amount of gastric wall binding mucus/mg Normal - 56.67 ±6.26 3.829 ±0.669 DM(ig)0.60 55.35 ±13.56 2.905 ±1.146*DM(ig)1.2 67.24 ±6.21＊＊ 3.025 ±0.67*DM(sc)0.45 40.01 ±13.50 3.564 ±0.548 DM(sc)0.90 59.18 ±9.89 2.886 ±0.963*

Tab 4 Pathological findings of dexamethasone on observation with an unaided eye in rats(n=10)

3.3知柏地黃丸和三九胃泰對地塞米松抑制小鼠胃腸道運動的影響結(jié)果(Tab 5)表明:與空白對照組相比，模型組小鼠腸推進率明顯降低，胃相對殘留率明顯增加(P＜0.01);與模型組比較，知柏地黃丸、三九胃泰組胃相對殘留率明顯降低(P＜0.01)，低于空白對照組，但知柏地黃丸組腸推進率無明顯改變，三九胃泰組腸推進率卻明顯高于模型組(P＜0.05)。提示三九胃泰能改善地塞米松誘發(fā)的小鼠胃腸道運動紊亂，抑制地塞米松導(dǎo)致的損傷。

Tab 5 Effect of Zhibodihuangwan and Sanjiuweitai on intestinal motility and gastric emptying of mice(±s，n=12)

Tab 5 Effect of Zhibodihuangwan and Sanjiuweitai on intestinal motility and gastric emptying of mice(±s，n=12)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group

Group Dose/g·kg-1 Relative residuce rate of intragastric dye/%Blank control - 56.7 ±7.7＊＊ 100.00 ±41.96 small intestinal propulsion rate/%＊＊Model - 48.7 ±11.1 167.24 ±83.98 Zhibaidihuang wan 3.75 47.4 ±8.9 78.04 ±31.93＊＊Sanjiuweitai 15.0 54.2 ±7.3* 94.46 ±34.41＊＊

3.4知柏地黃丸和三九胃泰對地塞米松引起的大鼠胃液、胃蛋白酶和胃酸、胃壁結(jié)合黏液量改變的影響結(jié)果(Tab 6)表明:與空白組相比，模型組胃液量增加(P＜0.05)，胃蛋白酶活力明顯升高(P＜0.01)，胃液pH值、胃壁結(jié)合黏液量明顯減少(P＜0.01);與模型對照組相比，知柏地黃丸組胃液pH值明顯升高(P＜ 0.01)，胃液量明顯降低(P＜ 0.05)，胃蛋白酶活力具有降低趨勢，胃壁結(jié)合黏液量具有升高趨勢，但未見統(tǒng)計學(xué)意義;與模型對照組相比，三九胃泰組胃液量明顯降低(P＜ 0.05)，胃液pH值明顯升高(P＜ 0.01)，胃蛋白酶活力明顯降低(P＜0.01)，胃壁結(jié)合黏液量明顯增加(P＜0.05)，提示三九胃泰能改善地塞米松引起的大鼠胃液、胃蛋白酶和胃酸、胃壁結(jié)合黏液量的改變，抑制地塞米松導(dǎo)致的損傷。

4 討論

文獻報道［5］:長期超生理劑量或大劑量使用糖皮質(zhì)激素常見食后惡心、噯氣、腹脹、上腹疼痛等消化系統(tǒng)機能紊亂癥狀，嚴(yán)重者可出現(xiàn)潰瘍、腸道出血及穿孔，然而利用地塞米松制備胃腸道功能紊亂的動物模型卻未見報道。隨著抗糖皮質(zhì)激素不良反應(yīng)藥物的研發(fā)，多方面探討糖皮質(zhì)激素誘發(fā)的疾病模型顯得非常有意義，筆者針對胃腸道紊亂這一病變制備了地塞米松致大、小鼠胃腸道功能紊亂模型?？紤]到中藥在抗糖皮質(zhì)激素不良反應(yīng)方面具有顯著地優(yōu)勢，因此選擇了多次給藥來制備該模型，以利于評價中藥的藥效。

文獻報道［4-5］糖皮質(zhì)激素誘發(fā)潰瘍的機制是:①刺激胃酸和胃蛋白酶的分泌，胃酸分泌增多;②抑制黏液的分泌，并使胃壁各層變薄甚至萎縮;③阻礙組織修復(fù)。本研究以SPF級大、小鼠為研究對象，由本研究的實驗結(jié)果可知:與正常組相比，給予地塞米松后小鼠胃腸運動被抑制、大鼠胃蛋白酶活力增加、胃液pH值降低、胃壁結(jié)合黏液量降低，提示本研究成功制作了地塞米松致大、小鼠胃腸機能紊亂的實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

在本研究前進行的預(yù)試研究中，給SD大鼠灌胃和皮下注射給予地塞米松組2.0 mg·kg-1，在d 4開始就會出現(xiàn)SD大鼠死亡;給昆明種小鼠灌胃和皮下注射給予地塞米松組2.0 mg·kg-1，在停藥d 2即發(fā)現(xiàn)部分小鼠死亡，因此未對此劑量進行相關(guān)指標(biāo)的檢測研究。綜合本研究結(jié)果，可以認(rèn)為在地塞米松導(dǎo)致大、小鼠胃腸道功能紊亂的試驗研究中，均以灌胃高劑量的造模效果顯著。因此，在本實驗條件下，建立較為理想的糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致胃腸道功能紊亂的模型用地塞米松的劑量和時間為:大鼠以地塞米松1.2 mg·kg-1連續(xù)灌胃 8 d，小鼠以 1.0 mg·kg-1連續(xù)灌胃 5 d。

Tab 6 Effect of Zhibodihuangwan and Sanjiuweitai on gastric acid and gastric pepsin activity of rats(±s)

Tab 6 Effect of Zhibodihuangwan and Sanjiuweitai on gastric acid and gastric pepsin activity of rats(±s)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model

Group Dose/g·kg-1 n volume of gastric juice/ml Amount of gastric wall binding mucus/mg Blank control - 13 3.4 ±1.4* 2.12 ±0.74＊＊ 54.68 ±18.60＊＊ 3.81 ±0.70 pH value of gastric juice Gastric pepsin activity/U＊＊Model - 13 5.3 ±2.1 1.52 ±0.31 71.22 ±14.0 3.00 ±0.75 Zhibaidihuang 2.40 10 4.1 ±2.2* 2.20 ±0.65＊＊ 65.62 ±17.75 3.35 ±0.81 Sanjiuweitai 10.0 10 3.9 ±1.8* 2.14 ±0.94＊＊ 52.13 ±19.23＊＊ 3.64 ±0.61*

為了驗證制備的模型，筆者從糖皮質(zhì)激素副作用特點考慮，選擇了知柏地黃丸和三九胃泰研究對制備模型(大鼠以地塞米松 1.2 mg·kg-1連續(xù)灌胃 8 d，小鼠以 1.0 mg·kg-1連續(xù)灌胃5 d)的治療作用，研究結(jié)果表明三九胃泰能改善地塞米松誘發(fā)的小鼠胃腸道運動紊亂，能改善地塞米松引起的大鼠胃液、胃蛋白酶和胃酸、胃壁結(jié)合黏液量的改變，從而抑制地塞米松導(dǎo)致的胃腸功能紊亂，知柏地黃丸只能部分改善，效果弱于三九胃泰。這一研究結(jié)果提示地塞米松誘發(fā)的大小鼠胃腸機能紊亂用適當(dāng)?shù)乃幬锸强梢阅孓D(zhuǎn)的。

綜上所述，筆者認(rèn)為建立較為理想的糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致胃腸道功能紊亂的模型用地塞米松的劑量和時間為:大鼠以地塞米松 1.2 mg·kg-1連續(xù)灌胃 8 d，小鼠以 1.0 mg·kg-1連續(xù)灌胃5 d;這些損傷用適當(dāng)?shù)乃幬锸强梢阅孓D(zhuǎn)的，該模型可以在防治糖皮質(zhì)激素不良反應(yīng)和胃腸機能紊亂研究中推廣應(yīng)用。

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