夏 維，王修珍，蔣小崗，顧振綸，郭次儀

(1.蘇州中藥研究所，2.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部病理學(xué)與病理生理學(xué)系，江蘇蘇州 215123)

藍(lán)萼甲素(Glaucocalyxin A)是由唇形科香茶菜屬植物香茶菜Rabdosia amethystoieds(Benth)Ham中分離提取出的二萜化合物［1］。研究證明不同濃度的藍(lán)萼甲素可抑制某些腫瘤細(xì)胞的增殖，如肝癌 BEL-7402細(xì)胞株［2］、卵巢癌HO8910細(xì)胞株［3］，然而，藍(lán)萼甲素抑制腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制尚未闡明。本文研究了藍(lán)萼甲素對(duì)人宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞凋亡及其生長(zhǎng)抑制作用，并初步探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料藍(lán)萼甲素，上海艾匯生物科技有限公司(純度≥99.7%，批號(hào):20100513)，溶于 DMSO 中配成50 mmol·L－1的母液;人宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞株，中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone)，MTT(噻唑藍(lán))、DMSO(二甲基亞砜)、PI(碘化丙啶)、RNA 酶(Sigma公司)，Hoechst 33258染色試劑盒(上海碧云天生物公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞增殖抑制測(cè)定采用 MTT法檢測(cè)不同濃度的藍(lán)萼甲素(1.25、2.5、5、10、20 μmol·L－1)對(duì) SiHa 細(xì)胞的毒性作用，570 nm處測(cè)吸光度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2Hoechst 33258染色法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于24孔板中，次日待細(xì)胞貼壁后給予藍(lán)萼甲素濃度分別為2.5、5、10 μmol·L－1，對(duì)照組加新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng) 24 h 后按試劑盒操作步驟進(jìn)行，熒光顯微鏡觀察、攝影。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期改變及凋亡率藍(lán)萼甲素處理細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞，體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇固定過(guò)夜，加入PI染色和RNA酶，37℃水浴30 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.4RT-PCR檢測(cè)bax、bcl-2、caspase-3、caspase-9 mRNA表達(dá)應(yīng)用Biozol體系，根據(jù)說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行RNA提取。按TaKaRa試劑盒逆轉(zhuǎn)錄mRNA為cDNA。以GAPDH作為內(nèi)參，以PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，多組比較采用方差分析法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用±s表示。

2 結(jié)果

2.1藍(lán)萼甲素對(duì)SiHa細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用分析藍(lán)萼甲素對(duì) SiHa細(xì)胞具有抑制增殖的作用，12、24、36、48、72 h 的IC50值分別為(17.33±1.90)、(6.84±0.41)、(4.27±0.55)、(2.96 ±0.62)、(1.98 ±0.91)μmol·L－1。隨著給藥濃度的增加，抑制率增加。給藥24 h后細(xì)胞抑制率分別為(10.89±2.08)%、(23.05±5.04)%、(42.77±2.14)%、(54.71±2.05)%、(81.96±0.46)%。表明藍(lán)萼甲素對(duì)Si-Ha細(xì)胞的增殖抑制作用呈明顯的時(shí)間－劑量依賴性。

2.2Hoechst 33258染色法觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化分析熒光顯微鏡下觀察，對(duì)照組細(xì)胞核大，呈圓形或橢圓形，核內(nèi)熒光弱，且亮度均一，呈淡藍(lán)色。給藥24 h后可見(jiàn)細(xì)胞核體積減小，細(xì)胞核由于濃集而著色深，呈亮藍(lán)色，部分細(xì)胞核呈分葉、碎片狀或邊集，并隨著給藥濃度的增加，趨勢(shì)更加的明顯。

2.3流式細(xì)胞儀分析不同濃度(2.5、5、10 μmol·L－1)的藍(lán)萼甲素作用SiHa細(xì)胞24 h后，流式分析結(jié)果顯示G1峰前出現(xiàn)亞G1峰，并呈現(xiàn)明顯的S期周期阻滯(Tab 1)。

Tab 1 Effect of Glaucocalyxin A on SiHa cells by flow cytometric analysis

2.4RT-PCR檢測(cè)分析不同濃度(2.5、5、10 μmol·L－1)的藍(lán)萼甲素作用SiHa細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組相比，隨著給藥濃度的增加 bcl-2 mRNA的表達(dá)下降(P＜0.01)，而 bax、caspase-3、caspase-9 mRNA的表達(dá)增加(P＜0.01)。

3 討論

本文研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)萼甲素能明顯抑制人宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖，且呈時(shí)間和劑量依賴性趨勢(shì)，流式細(xì)胞分析結(jié)果呈現(xiàn)明顯的sub-G1峰和S期周期阻滯，提示這種抑制與其誘導(dǎo)SiHa細(xì)胞凋亡和細(xì)胞阻滯于S期有關(guān)。

細(xì)胞凋亡的線粒體損傷的內(nèi)源性途徑通過(guò)活化caspase-9來(lái)激活凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者caspase-3［4］。激活的caspase-3裂解相應(yīng)的胞質(zhì)胞核底物，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［5］。有文獻(xiàn)報(bào)道［6］bcl-2通過(guò)和caspase家族蛋白的作用來(lái)抑制凋亡的發(fā)生。bcl-2抗凋亡的機(jī)制主要有拮抗促凋亡基因bax，抑制促凋亡的蛋白質(zhì)細(xì)胞色素C的釋放，從而阻止細(xì)胞色素C激活caspase-3［7］。bax基因編碼的bax蛋白可以與bcl-2蛋白形成異二聚體，對(duì)bcl-2產(chǎn)生阻抑作用［8］。本實(shí)驗(yàn)證明藍(lán)萼甲素能降低 SiHa細(xì)胞中 bcl-2 mRNA的表達(dá)，解除其對(duì)caspase-3的抑制，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。本文RT-PCR分析結(jié)果顯示經(jīng)藍(lán)萼甲素處理后細(xì)胞的bcl-2 mRNA表達(dá)下降，而bax、caspase-3、caspase-9 mRNA表達(dá)增加，這說(shuō)明藍(lán)萼甲素能通過(guò)下調(diào) bcl-2基因的表達(dá)，同時(shí)上調(diào) bax、caspase-3、caspase-9基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和S期阻滯來(lái)抑制SiHa細(xì)胞的生長(zhǎng)。

綜上所述，藍(lán)萼甲素在體外明顯抑制人宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞株的增殖，并通過(guò)下調(diào)bcl-2的表達(dá)和上調(diào)bax、caspase-3、caspase-9的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡和周期阻滯。但其體內(nèi)作用機(jī)制與體外實(shí)驗(yàn)是否一致以及臨床療效還有待進(jìn)一步研究。

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