李春明

(林木育種國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室(北京林業(yè)大學(xué))，北京，10083)

白 卉

(黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所)

于文喜

(黑龍江省林業(yè)科學(xué)院)

溫度是重要的環(huán)境因子之一，主要影響植物分布以及生長(zhǎng)、發(fā)育等多個(gè)生命過程［1］。溫帶木本植物通過休眠可以避開冬季極端低溫，但早春與晚秋季節(jié)仍面臨低溫脅迫風(fēng)險(xiǎn)。通過低溫馴化增強(qiáng)抗寒能力是木本植物應(yīng)對(duì)秋季低溫脅迫的重要方式之一。該過程主要表現(xiàn)為生長(zhǎng)減緩或停止，伴隨大量活性氧的生成［2］，含水量降低［3］等。另外低溫馴化過程會(huì)改變基因表達(dá)［4－7］，主要表現(xiàn)蛋白表達(dá)上調(diào)，如抗凍蛋白［8］，熱激蛋 白 (HSP)［9］，穩(wěn)定蛋白［10］，晚期胚胎富集蛋白(LEA)［11］等。

大青楊(P.ussuriensis Kom)，又稱憨大楊、哈達(dá)楊。自然分布于我國(guó)東北的長(zhǎng)白山、小興安嶺林區(qū)，材質(zhì)優(yōu)良，抗寒性強(qiáng)，是東北三省東部山區(qū)森林更新的主要樹種之一［12］。在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中，大青楊形成了特有的低溫適應(yīng)機(jī)制，但對(duì)其低溫適應(yīng)機(jī)制研究不夠深入，暫未見有關(guān)大青楊低溫分子適應(yīng)機(jī)制方面的研究。蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的執(zhí)行者，直接影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，通過對(duì)大青楊休眠前低溫馴化過程中蛋白質(zhì)差異表達(dá)的研究，尋找其低溫馴化過程中起作用的重要蛋白質(zhì)，能夠從蛋白質(zhì)水平研究其低溫適應(yīng)機(jī)制，對(duì)全面研究大青楊抗寒機(jī)理具有重要的理論及實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 植物材料

大青楊為同一無性系，通過硬枝扦插繁殖，于2010年5月初定植于規(guī)格為20 cm×16 cm×20 cm的塑料花盆中，置于黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所溫室外，培養(yǎng)基質(zhì)為V(腐殖土)∶V(河沙)=3∶1，每周澆水2次，10～15 d噴施1次10%MS溶液，培養(yǎng)4個(gè)月后開始試驗(yàn)。2010年9月8日、9月21日、10月6日，于上午9:00時(shí)至10:00時(shí)，選擇3株長(zhǎng)勢(shì)一致幼苗，每株取功能葉5～8片，混合后放于冰箱中－80℃保存，用于蛋白質(zhì)分析。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

Ettan IPGphor II等電聚焦系統(tǒng)、Ettan DALT twelve垂直電泳系統(tǒng)、SE600電泳儀掃描儀、自動(dòng)染膠儀(美國(guó)通用)、高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)、紫外分光光度計(jì)、Powerlook 2100XL UMAX掃描儀(臺(tái)灣)。

1.3 主要試劑

固相 pH 值 4.0～7.0，24 cm 梯度干膠條、2D－Quant試劑盒、丙烯酰胺(Acrylamide)、甲叉雙丙烯酰胺(Bis－Acrylamide)，均購(gòu)自 Amersham Biosciences公司。苯甲基磺酰氟(PMSF)、碘乙酰胺、二硫蘇糖醇(DTT)、N'N'N'N'－四甲基乙二胺(TEMED)購(gòu)自Sigma公司;Trizol購(gòu)自Invitrogen公司，Tris－base、溴酚藍(lán)、蛋白 Marker、三氯乙酸(TCA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、牛血清白蛋白(BSA)、考馬斯亮藍(lán)R－350、低熔點(diǎn)瓊脂糖、β－巰基乙醇(β－ME)購(gòu)自 BBI(Bio Basic Inc，Canada)。胰蛋白酶、酶抑制劑購(gòu)自德國(guó)Roche公司。其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。所有溶液均用Milli－Q制備的純水配制。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

樣品制備:蛋白質(zhì)提取方法采用三氯醋酸/丙酮沉淀法［13］。

蛋白質(zhì)樣本的定量:應(yīng)用Amersham Biosciences公司的2D－Quant試劑盒，進(jìn)行蛋白質(zhì)樣本的定量。具體操作步驟見Amersham Biosciences公司提供的雙向電泳原理和方法。

雙向電泳:①第一向等電聚焦(IEF)。初始IEF:100 V 1 h，200 V 1 h，500 V 1 h，1 000 V 1 h，1 000～8 000 V 1 h;IEF 到穩(wěn)定狀態(tài):8 000 V 10 h。②IPG膠條平衡和第二向 SDSPAGE電泳。IPG膠條平衡參照Amersham Biosciences公司提供的雙向電泳原理和方法，平衡后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠，將平衡好的IPG膠條用電泳緩沖液沖洗后膠面朝外小心置于第二向PAGE膠上，在膠的上面加入低熔點(diǎn)瓊脂糖封閉液(0.5%瓊脂糖，0.002%溴酚藍(lán)溶于SDS電泳緩沖液中)，待瓊脂糖凝固后即可進(jìn)行第二向SDS凝膠電泳。電泳條件見表1。

表1 第二向Ettan DALT twelve系統(tǒng)電泳參數(shù)

染色:采用考馬斯亮藍(lán)染色法［14］。

凝膠掃描:凝膠顯色后用UMAX 2100XL掃描儀進(jìn)行圖像掃描，圖像掃描儀經(jīng)強(qiáng)度矯正后，透射掃描2－DE凝膠(光學(xué)分辨率300像素，象素深度8bite)。

圖像分析:所得2－DE圖譜利用PDQuest V 8.0圖像分析軟件進(jìn)行分析處理。

蛋白質(zhì)的膠內(nèi)酶解:方法參見畢影東方法［15］，略有改動(dòng)，加入酶液后，改水浴為37℃空氣浴倒置酶解12～14 h。

蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析:Ultraflex TM MALDI－TOF－MS質(zhì)譜儀檢測(cè)，獲得蛋白點(diǎn)的肽指紋圖譜(PMF)信息。

數(shù)據(jù)分析及Mascot數(shù)據(jù)庫(kù)搜索:應(yīng)用本地服務(wù)器上的Matrix server 2.0模塊選擇毛果楊蛋白庫(kù)(網(wǎng)站http://www.ncbi.nlm.nih.gov)對(duì) PMF信息進(jìn)行檢索。蛋白選擇胰蛋白酶(Trypsin)，可變修飾選擇(Oxidation)，固定修飾選擇(Carbamidomethyl)，肽段質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)偏差:±10－4。

蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析:使用本地Perl程序根據(jù)蛋白GI號(hào)從毛果楊蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(http://genome.jgipsf/poptrl_1/poptrl_1.home.html)中抽提目的序列。應(yīng)用Blast2Go程序進(jìn)行Go(gene ontology)分類。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙向電泳圖譜

大青楊在9月8日、9月21日、10月6日葉片中蛋白質(zhì)的雙向電泳圖譜見圖1，在pH值4.0～7.0的范圍內(nèi)3個(gè)樣品經(jīng)R－350染色后分別得到了853、988、1192個(gè)清晰可分辨的蛋白點(diǎn)。用分析軟件PDQuest 8.0對(duì)蛋白點(diǎn)進(jìn)行比較，共獲得538個(gè)匹配的蛋白點(diǎn)，蛋白點(diǎn)多分布在膠的中上部。

圖1 低溫脅迫下楊樹葉片中蛋白質(zhì)的雙向電泳圖譜

2.2 差異蛋白點(diǎn)的選擇

使用PDQuest8.0軟件，對(duì)大青楊3個(gè)時(shí)期蛋白質(zhì)點(diǎn)的表達(dá)豐度(由軟件根據(jù)蛋白質(zhì)點(diǎn)的灰度生成的數(shù)量值)進(jìn)行差異檢測(cè)，選擇相對(duì)表達(dá)豐度大于200%的蛋白質(zhì)點(diǎn)作為差異蛋白點(diǎn)，共94個(gè)(見圖2)。

2.3 差異表達(dá)蛋白點(diǎn)質(zhì)譜鑒定結(jié)果

對(duì)94個(gè)差異蛋白點(diǎn)從膠上回收、酶解后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，78個(gè)蛋白點(diǎn)得到了完整的肽指紋圖譜，在毛果楊與植物蛋白庫(kù)中進(jìn)行搜索，其中45個(gè)蛋白質(zhì)得到了鑒定，結(jié)果見表2。

已鑒定的45個(gè)蛋白中有40個(gè)蛋白表達(dá)量上調(diào)2倍以上，其中有4個(gè)蛋白點(diǎn)(19、37、58、90)第1個(gè)時(shí)期未見表達(dá)，后兩個(gè)時(shí)期表達(dá)量大增;只有5個(gè)蛋白點(diǎn)(53、60、67、72、92)表達(dá)量下調(diào)2倍以上，蛋白點(diǎn)67在最后1個(gè)時(shí)期未見表達(dá)。另外，出現(xiàn)同一蛋白質(zhì)出現(xiàn)在蛋白圖譜不同位置的現(xiàn)象，蛋白點(diǎn) 4、5、6、7，蛋白點(diǎn) 23、25，蛋白點(diǎn) 39、41，蛋白點(diǎn) 9、67 4 組蛋白肽指紋圖譜信息相同，但蛋白點(diǎn)可以通過雙向電泳分開(見表2)，蛋白點(diǎn)39、41相對(duì)分子質(zhì)量與等電點(diǎn)均有較大差異，其它3組蛋白相對(duì)分子質(zhì)量幾乎相同，由于等電點(diǎn)差異而被分開(見圖2)。

2.4 蛋白功能分類

植物低溫馴化是一個(gè)復(fù)雜的生理過程，眾多蛋白參與這一過程，一個(gè)蛋白可能執(zhí)行多個(gè)功能。對(duì)已鑒定的45個(gè)蛋白進(jìn)行功能分類，結(jié)果表明22個(gè)(42%)是脅迫響應(yīng)蛋白，12個(gè)(23%)與呼吸作用相關(guān)，9個(gè)(17%)與光合作用相關(guān)，5個(gè)(10%)參與其它生理過程，還有4個(gè)(8%)功能未知。

3 討論

3.1 利用肽指紋圖譜鑒定蛋白質(zhì)

PMF是利用測(cè)量酶解肽段相對(duì)分子質(zhì)量并與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定的一項(xiàng)技術(shù)。蛋白點(diǎn)4、5、6、7的PMF信息相同，相對(duì)分子質(zhì)量基本相同，等電點(diǎn)不同，推測(cè)這4個(gè)蛋白點(diǎn)可能為同一蛋白經(jīng)翻譯后修飾(磷酸化、甲基化、糖基化等)而造成的等電點(diǎn)差異。由于PMF提供的信息有限，不能對(duì)翻譯后修飾進(jìn)行鑒定，所以這4個(gè)蛋白被鑒定為同一蛋白。類似情況還蛋白點(diǎn)23、25，蛋白點(diǎn)9、67。蛋白點(diǎn)39、41的PMF信息相同，相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)均不同，推測(cè)這兩個(gè)蛋白可能是由同一基因家族控制的旁系同源基因產(chǎn)物，或者為同一蛋白攜帶不同信號(hào)分子或目標(biāo)靶序列而形成異構(gòu)體［16］。

圖2 差異蛋白點(diǎn)在膠圖上的分布(以大青楊9月8日膠圖為例)

3.2 與脅迫相關(guān)蛋白

熱激蛋白(HSPs)是一類在生物體遭受高溫脅迫時(shí)合成的保守多肽序列蛋白質(zhì)［17］，又被稱為脅迫相關(guān)分子伴侶［18］。大量研究表明，低溫［19－21］、干旱、鹽漬、水淹等多種逆境脅迫也能誘導(dǎo)熱激蛋白的積累［22］。熱激蛋白參與變性蛋白的重新折疊，防止變性蛋白聚合，參與穩(wěn)定膜系統(tǒng)等多個(gè)生命過程［23－24］。本研究所鑒定的45個(gè)蛋白中13個(gè)屬于熱激蛋白/分子伴侶類，10 個(gè)屬于熱激蛋白 70 家族(點(diǎn) 4、5、6、7、9、10、16、39、41、67)，1 個(gè)屬于熱激蛋白 90 家族(點(diǎn) 8)，2 個(gè)屬于伴侶蛋白前體(點(diǎn)1、45)。除點(diǎn)67表達(dá)量下調(diào)外，其它12個(gè)蛋白在自然低溫馴化過程中表達(dá)量均顯著上調(diào)。表明熱激蛋白/分子伴侶蛋白在大青楊低溫馴化過程中起到重要作用。

其它與脅迫響應(yīng)蛋白 9 個(gè)(11、12、13、21、22、46、58、90、92)，在大青楊自然低溫馴過程中，除抗病蛋白(點(diǎn)92)表達(dá)量下調(diào)外，其余表達(dá)量均上調(diào)，與前人研究結(jié)論基本一致。其中蛋白點(diǎn)21(磷酸甘油酸變位酶)［1］與蛋白點(diǎn)90(ATP合酶)是三羧酸循環(huán)關(guān)鍵酶［25］，低溫馴化過程中，三羧酸循環(huán)關(guān)鍵酶表達(dá)量上調(diào)，會(huì)促進(jìn)下游產(chǎn)物及ATP生成，為大青楊應(yīng)對(duì)低溫脅迫提供必需的物質(zhì)及能量。蛋白點(diǎn)46(抗壞血酸過氧化物酶)與蛋白點(diǎn)58(過氧化還原酶)等抗氧化酶表達(dá)量上調(diào)，有助于清除大青楊低溫脅迫下產(chǎn)生的過量活性氧，該結(jié)果與Renaut研究相似［20］。

3.3 與呼吸作用相關(guān)蛋白

呼吸作用是植物細(xì)胞最基本的生命活動(dòng)，環(huán)境脅迫下，能量代謝加強(qiáng)是植物抵御逆境的基本特征。本研究中，低溫脅迫條件下共鑒定出12個(gè)與呼吸作用相關(guān)蛋白，包括溫度敏感絲狀脅迫響應(yīng)蛋白(點(diǎn)11)，細(xì)胞分裂蛋白(點(diǎn)12)，Rubisco β亞基(點(diǎn)13、14)，翻譯延伸因子G(點(diǎn)17)，磷酸甘油酸變位酶(點(diǎn)21)，羧化酶前體(點(diǎn)23、25)，蘋果酸脫氫酶(36)，脫氫酶亞基(37)，酯酶D(點(diǎn)62)，ATP合酶(點(diǎn)90)等在低溫脅迫下表達(dá)量都顯著上調(diào)。

表2 低溫脅迫下楊樹葉片蛋白點(diǎn)質(zhì)譜鑒定

能量代謝是各種生命活動(dòng)的基礎(chǔ)代謝，不僅為各種生命活動(dòng)提供必需的ATP，還為眾多代謝過程提供中間代謝產(chǎn)物。蛋白點(diǎn)36為蘋果酸脫氫酶是三羧酸循環(huán)中起重要作用的酶［26］，其表達(dá)豐度上調(diào)會(huì)促進(jìn)能量生成及下游物質(zhì)的合成，為大青楊低溫馴化及抵御低溫脅迫提供必要的能量及物質(zhì)。

3.4 與光合作用相關(guān)蛋白

光合作用是綠色植物將光能固定及物質(zhì)合成的過程，也是各種生命活動(dòng)的起點(diǎn)。葉綠體是進(jìn)行光合作用的細(xì)胞器，由于低溫等逆境脅迫會(huì)對(duì)葉綠體類囊體膜造成傷害，因此，必將影響植物的光合代謝，從而影響植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育［19］。本研究從大青楊葉片中鑒定與光合作用相關(guān)的蛋白包括溫度敏感絲狀脅迫響應(yīng)蛋白(點(diǎn)11)，細(xì)胞分裂蛋白(點(diǎn)12)，葉綠體蛋白酶(點(diǎn)22)，Rubisco大亞基(點(diǎn)52、61)，葉綠體銅鋅超氧化物歧化酶(點(diǎn)57)，葉綠體放氧蛋白(點(diǎn)71)等7個(gè)蛋白在自然低溫馴化過程中蛋白表達(dá)量顯著上調(diào);ATP合酶δ鏈(點(diǎn)53)，葉綠體放氧蛋白(點(diǎn)72)等2個(gè)蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)。

Xiao等［27］研究表明，抗旱能力差的楊樹葉片中Rubisco大亞基在干旱脅迫下表達(dá)量下調(diào)。Zhao Yan等［25］發(fā)現(xiàn)狗牙根葉片在干旱脅迫下，葉綠素結(jié)合蛋白、葉綠體放氧蛋白、ATP合酶與Rubisco大亞基表達(dá)均下調(diào)，直接影響光合作用捕光過程、電子傳遞及碳同化3個(gè)主要過程。本研究中，只有ATP合酶δ鏈、葉綠體放氧蛋白2個(gè)蛋白表達(dá)量下調(diào)，表明大青楊在自然低溫馴化過程中光反應(yīng)的光合放氧及光合磷酸化過程受到影響。

3.5 其它蛋白及功能未知蛋白

除以上3類主要蛋白外，本研究還鑒定了翻譯延伸因子G(點(diǎn)17)，前序列蛋白酶(點(diǎn)19)、細(xì)胞質(zhì)動(dòng)力蛋白重鏈(點(diǎn)44)、酯酶D(點(diǎn)62)、抗病蛋白(點(diǎn)92)以及4個(gè)未知功能蛋白(34、51、60、70)。這些蛋白質(zhì)在自然低溫馴化過程中表達(dá)量變化明顯，可能執(zhí)行某種生物學(xué)功能。由于目前對(duì)這些蛋白功能信息了解有限，它們?cè)诖笄鄺钭匀坏蜏伛Z化中的表達(dá)變化與其在適應(yīng)低溫脅迫的調(diào)節(jié)機(jī)制和功能還需要進(jìn)一步的研究。

3.6 蛋白質(zhì)在大青楊低溫馴化過程中的作用

大青楊是黑龍江省鄉(xiāng)土樹種，在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中形成了特有低溫適應(yīng)機(jī)制。通過本研究可以推測(cè)，蛋白質(zhì)表達(dá)量變化與大青楊低溫馴化關(guān)系密切。大青楊在低溫及短光周期的誘導(dǎo)下，熱激蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)。熱激蛋白一方面作為功能蛋白參與變性蛋白的重新折疊，防止變性蛋白聚合，穩(wěn)定新生成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等;另外熱激蛋白也起到轉(zhuǎn)導(dǎo)脅迫信號(hào)并激活相關(guān)基因表達(dá)的作用。在熱激蛋白調(diào)節(jié)下，大青楊葉片中呼吸作用相關(guān)蛋白、抗氧化酶表達(dá)量上調(diào)，而參與光反應(yīng)的蛋白表達(dá)量則顯著下調(diào)，進(jìn)而調(diào)整生理狀態(tài)，逐步完成低溫馴化過程，為抵御低溫脅迫做好準(zhǔn)備，見圖3。

圖3 蛋白質(zhì)豐度變化與大青楊低溫馴化關(guān)系

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