張文波，冷 闖，鄧舜洲＊，蔣新華，余根蓮

（1.江西農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，江西南昌 330045；2.南昌金牧動物保健服務有限公司，江西南昌 330013）

2010年9月初，江西某規(guī)模化鴨場的雛鴨突然發(fā)病，發(fā)病率高達100%，病死率40%左右。主要臨床癥狀為嗜睡，共濟失調(diào)，食欲減退或廢絕，排黃綠色或惡臭稀糞，有的鴨迅速死亡。用磺胺和喹喏酮類藥物效果不明顯。剖檢主要病理變化有肝周炎、纖維素性心包炎、脾臟呈紫黑色斑紋狀、肺有淤血或水腫，腹水為淡黃色、腸道黏膜呈卡他性或壞死性炎癥。實驗室診斷為大腸埃希菌病，并分離到一株強毒力大腸埃希菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 江西某養(yǎng)鴨場的病死鴨。

1.1.2 藥敏紙片 （批號：20101006）和微量生化鑒定管（批號：20101102）均為杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 試驗用動物 20日齡非免疫櫻桃谷鴨購自南昌市某種鴨場；昆明系小鼠，體重15g左右，購自于南昌大學實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離培養(yǎng) 在無菌條件下取送檢病死鴨的肝臟、心臟，劃線接種于兔血瓊脂平板、普通瓊脂平板和麥康凱平板，37℃培養(yǎng)12h，觀察菌落形態(tài)、大小和顏色等，挑單個菌落進行革蘭染色鏡檢，觀察細菌形態(tài)特征。挑單個菌落分別接種于伊紅美藍瓊脂平板和SS瓊脂平板，37℃培養(yǎng)12h，觀察細菌的培養(yǎng)特性。

1.2.2 生化試驗 挑取分離菌純培養(yǎng)物接種于普通肉湯培養(yǎng)基中，37℃、200r／min，振蕩培養(yǎng)10h～12h。然后將培養(yǎng)的菌液接種于微量生化鑒定管，37℃培養(yǎng)24h后，觀察結(jié)果。

1.2.3 動物試驗 取培養(yǎng)的菌液進行細菌計數(shù)，并稀釋到濃度為105cfu／mL，取0.2mL通過腹腔注射小鼠，同時用普通肉湯進行腹腔注射小鼠作正常對照；取分離菌培養(yǎng)液0.2mL皮下接種雛鴨，同時用普通肉湯皮下接種雛鴨作正常對照，觀察實驗動物的發(fā)病及死亡情況，并從死亡實驗動物的肝臟和心臟中分離細菌。

1.2.4 藥敏試驗 用無菌棉簽將培養(yǎng)的菌液均勻涂布于普通瓊脂平板上，貼藥敏紙片，37℃，培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈的直徑。判定標準參照文獻［1］進行。

1.2.5 臨床治療 使用藥敏試驗篩選的高度敏感藥物進行治療，并采取消毒等綜合防控措施，觀察治療效果。

2 結(jié)果

2.1 細菌的分離純化

劃線接種的平板，37℃培養(yǎng)12h。在血平板上形成圓形、稍凸、邊緣整齊、灰白色、不透明的菌落，有明顯的β溶血環(huán)；普通培養(yǎng)基上形成均一的菌落，呈中等大小、圓形、凸起、濕潤、灰白色半透明、邊緣整齊。革蘭染色為陰性，散在或成對排列、兩端鈍圓的短桿菌。麥康凱培養(yǎng)基上形成紅色、圓形隆起、濕潤和邊緣整齊的中等大小菌落。從麥康凱培養(yǎng)基上挑單個菌落接種于伊紅美藍平板上，可形成紫黑色帶金屬光澤的菌落。SS瓊脂平板上形成紅色的菌落。

2.2 生化試驗結(jié)果

該分離菌株能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、木糖、乳糖、棉子糖和山梨醇，產(chǎn)酸產(chǎn)氣；鼠李糖、觸酶和甲基紅陽性；吲哚、H2S、枸櫞酸鹽、VP和尿素為陰性。符合大腸埃希菌的生化特征。結(jié)合分離菌的形態(tài)、培養(yǎng)特性及部分生物學性狀，鑒定為大腸埃希菌。

2.3 動物試驗結(jié)果

腹腔注射分離菌培養(yǎng)液的5只小鼠在12h內(nèi)全部死亡；皮下注射分離菌培養(yǎng)液的5只雛鴨在16 h內(nèi)全部死亡。剖檢發(fā)現(xiàn)小鼠的心臟和腸道出血、肝上有針尖大小出血點、脾臟呈深黑色；雛鴨有肝周炎、心包積液、纖維素性滲出、腸道出血嚴重等病變。從死亡小鼠和雛鴨的心臟、肝臟以及腹水中分離細菌，細菌的形態(tài)等生物學特性，與從病死鴨肝臟和心臟中分離的細菌一致。普通肉湯對照組全部存活。

2.4 藥物敏感試驗結(jié)果

分離菌株對阿莫西林棒酸、頭孢克洛、奈替米星和紅霉素高度敏感，對呋喃唑酮、大觀霉素、頭孢噻吩、慶大霉素、氧氟沙星和氨芐西林中度敏感，對其他藥物為低敏或耐藥（表1）。

表1 藥敏試驗結(jié)果Table 1 The results of drug sensitive test of isolate strains

3 討論

根據(jù)分離菌的培養(yǎng)特性、形態(tài)特征、生化試驗結(jié)果，確定該分離菌為大腸埃希菌。分離的大腸埃希菌分別在12h致死小鼠和16h內(nèi)致死雛鴨，死亡雛鴨的病理變化與自然感染死亡鴨的病理變化完全一致［2－3］，且鴨場的發(fā)病率和死亡率均較高，表明本次分離菌是強致病性的大腸埃希菌。

藥敏試驗結(jié)果表明，分離菌對頭孢噻呋鈉、阿莫西林／棒酸、紅霉素和奈替米星高度敏感，對大觀霉素、慶大霉素、頭孢噻吩、克林霉素和左氧氟沙星中度敏感，對其它藥物均低敏或耐藥。原因可能與這類藥物在臨床上應用不廣泛、聯(lián)合用藥效果要優(yōu)于單藥等有關，與其他學者的研究結(jié)果相似［4－6］。根據(jù)藥敏試驗結(jié)果，在發(fā)病鴨場使用頭孢噻呋鈉進行治療，連用3d，效果不明顯。換用阿莫西林／棒酸配合大觀霉素注射治療，同時采取消毒、加強管理等綜合防治措施，很快控制了疫情。

隨著養(yǎng)鴨場抗生素使用的常態(tài)化，大腸埃希菌的耐藥性也隨之不斷增強、變化；而且大腸埃希菌的血清型眾多，交叉保護性差，疫苗免疫效果不佳，因此通過藥敏試驗篩選高敏藥物是治療和控制鴨大腸埃希菌病的有效途徑之一［7］。但在臨床上經(jīng)常會出現(xiàn)臨床治療和藥敏試驗結(jié)果不相符的情況，其原因主要有：①體外和體內(nèi)環(huán)境不同［8］，體內(nèi)某些細菌可以合成降解抗生素的酶，使抗生素失效，就會出現(xiàn)體外敏感而體內(nèi)耐藥的情況；②某些致病菌在體外培養(yǎng)時，因條件與體內(nèi)不同，可能發(fā)生變異而產(chǎn)生耐藥性或失去耐藥性；③致病菌判斷不正確，或者未分離到［9］。④藥敏試驗方法選擇錯誤導致藥敏試驗結(jié)果不正確。例如根據(jù)CLSI藥敏試驗規(guī)范，非腸桿菌科革蘭陰性桿菌除銅綠假單胞菌和不動桿菌可用K－B法外，假單胞菌屬其他細菌、嗜麥芽窄食單胞菌和其他不發(fā)酵葡萄糖的革蘭陰性桿菌的藥敏試驗均需用稀釋法；⑤藥敏紙片失效，造成假耐藥情況。如放置時間過長、未按要求放置等；⑥臨床用藥劑量與藥敏試驗的實際劑量有較大差異［10］；⑦臨床上部分細菌是條件性病原菌，要有誘因才有可能致病，若單純用藥而未清除誘因，用藥也可能無效。本研究在治療過程中出現(xiàn)高敏藥物頭孢噻呋鈉治療無效，其原因有待于進一步研究。大腸埃希菌是一種條件性致病菌，只有當動物在飼養(yǎng)管理不當、應激、機體抵抗力降低時，才會引起較嚴重的病癥，因此在養(yǎng)鴨場應在加強飼養(yǎng)管理，降低鴨群密度，及時消毒，做好生物安全措施、減少應激、及時隔離和淘汰病雞等方面的工作，才能有效減少該病造成的經(jīng)濟損失。

［1］Clinical and laboratory standards institute（CLSI）.Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing Twentieth；informational Supplement［S］.Document M100－S20.Wayne，PA：Clinical and Laboratory Standards Institute，2010：59－123.

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