毛開榮

（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京海淀 100081）

布氏菌病（又稱布魯氏菌病，以下簡稱布病）是一種細菌性人畜共患傳染病。世界大多數(shù)國家都有流行。由于帶菌動物是其它動物和人類布病的主要傳染源，因此，對動物的布病的診斷、防治就成為本病防治的關鍵。迄今，有多種技術成熟、可用國際標準來標定、比較的血清學方法可供診斷用。病原診斷也已經(jīng)有成熟的分子生物學診斷技術。免疫學診斷方法方面的研究，主要集中在抗原篩選和新技術研究方面，包括脂多糖（LPS）、蛋白抗原的篩選研究，酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）診斷技術、熒光偏振試驗（FPA）診斷技術、免疫層析法診斷技術、補體結合酶聯(lián)免疫吸附試驗（CF-ELISA）診斷技術、聚合酶鏈式反應（PCR）診斷技術等。此外。對診斷技術的評價研究也有大量報道。

一、診斷標準

診斷標準是得到官方認可的技術，具有法律效力。在布氏菌病的防控中，各國都有其診斷標準，國際組織也有其指定的或推薦的標準。各國的標準有的是相同的，有的不同，其差異主要在于技術研發(fā)的不同和根據(jù)國情對防控的需要不同。

中國有關動物布病的標準有3個。其中《動物布氏菌病診斷技術》（GBT 18646-2002）涉及的技術方法有：虎紅平板凝集試驗（RBT）、全乳環(huán)狀試驗(MRT)、試管凝集試驗(SAT)和補體結合試驗(CFT)。《奶牛布氏菌病PCR診斷技術》（NY/T 1467-2007）涉及的技術方法為PCR檢測病原?！恫际暇》乐渭夹g規(guī)范》（2007年7月17日農(nóng)業(yè)部）則描述了流行特點、臨床癥狀、病理變化、病原分離鑒定，并將GBT 18646-2002的 RBT、MRT、SAT和CFT列為標準內(nèi)容，強調了病畜和疫情的綜合判定方法，此外對疫情的報告處理，預防和控制進行了敘述，是比較全面的布氏菌病防控標準。中國有關人布病的標準是《布氏菌病診斷標準》WS268-2007，該標準規(guī)定診斷的依據(jù)是流行病學史、臨床表現(xiàn)和實驗室檢查，實驗室檢查的方法包括用于初篩的平板凝集試驗或RBT，血清學檢查的SAT、CFT、抗人免疫球蛋白試驗，以及分離細菌，規(guī)定了診斷原則，疑似、確診、隱性感染診斷標準和鑒別診斷要點?！恫际暇z測標準》GB 16885-1997是衛(wèi)生系統(tǒng)起草和解釋的國家標準，對監(jiān)測點的選擇、監(jiān)測內(nèi)容、監(jiān)測方法作出了規(guī)定。

表1 歐盟成員國布病篩選和確診試驗

表2 某地區(qū)布氏菌檢出年代分布情況

OIE作為世界貿(mào)易組織（WTO）指定負責制定動物衛(wèi)生安全標準的唯一國際組織，其《陸生動物診斷試驗和疫苗手冊》中關于牛布氏菌病和羊布氏菌病診斷技術也得到各國的重視。手冊中有關布病病原診斷的技術有：細菌染色與分離鑒定、PCR檢測；血清學診斷的技術有：作為國際貿(mào)易規(guī)定試驗的RBT、緩沖平板凝集試驗、CFT、ELISA、熒光偏振試驗(FPA)，以及不作為規(guī)定試驗的皮膚變態(tài)反應、SAT、用半抗原和胞質蛋白進行的免疫擴散試驗、MRT、r-干擾素試驗。

在歐盟牛布病診斷中，多數(shù)國家用RBT作為篩選試驗，以CFT作為確診試驗，有些國家用SAT和 ELISA作為篩選試驗，以CFT作為確診試驗。對于牛奶樣品，多數(shù)國家用MRT作為篩選試驗，以ELISA作為確診試驗，但也有國家僅用ELISA。有些國家還用皮膚變態(tài)反應。

美國在其2003年公布的布病消滅計劃中，布病實驗室診斷要求是：用酸化緩沖平板凝集試驗、快速自動試驗、卡片試驗作為篩選試驗，以標準試管凝集試驗和標準平板凝集試驗測定抗體滴度，用利凡諾爾試驗、CFT、FPA作為確診試驗。MRT、系列稀釋RBT和牛奶ELISA作為牛奶樣品的監(jiān)測試驗。

從以上所述的國際組織和各國布病診斷標準中可以看出，對于布病診斷都采用了篩選試驗與確診試驗相結合的標準規(guī)定，并且都以緩沖類平板凝集試驗（包括RBT）作為主要篩選試驗方法，在確診試驗中都包括了CFT，說明這2種試驗是獲得普遍認可的布病診斷技術。而MRT則是普遍使用的牛奶樣品檢測方法。

二、診斷方法及其評價

（一）病原學診斷方法

1.細菌學方法。世界上已發(fā)現(xiàn)布氏菌有9個種，其中田鼠種布氏菌(B.microti) 2008年由德國和捷克科學家發(fā)現(xiàn)，在我國流行的布病病原菌主要是羊種菌，此外，還存在牛種、豬種、犬種等。

迄今，細菌學方法依然是病原診斷的主要方法。傳統(tǒng)的樣品涂片染色鏡檢、分離培養(yǎng)鑒定，雖然檢出率很低，但卻是診斷“金標準”。但由于細菌學檢測難以獲得帶菌樣品等原因，其檢出率很低，并且存在生物安全風險，因此在生產(chǎn)實踐中使用率很低。

2.分子生物學技術。20世紀90年代以來，分子生物學技術以其快速、準確、高效成為布氏菌檢測研究較多的方法。Betsy J BricKer和Shirley M Halling在1994年針對牛、羊、綿羊、豬種布氏菌設計不同的引物，應用PCR技術擴增在不同種間存在重復差異的布氏菌保守重復基因單元IS711,對美國107株野外分離菌株進行檢測，能夠全部鑒定，并與傳統(tǒng)方法檢測結果符合率達100%。說明這一方法在布氏菌種的鑒定方面敏感、可信，對美國流行種可以全部檢出。1999年Serpe L等報道了用PCR一步法快速檢測軟質干酪和牛乳中的布氏菌。2000年Sreevatsan S等報道用聯(lián)合PCR對感染牛的乳汁、鼻分泌物檢測布氏菌和結核菌。Cloeckaert A等報道位于IS711序列下游的26bp基因是海洋哺乳動物的特殊標記。用過氧化物酶標記或熒光標記的特異性免疫染色檢驗技術已有報道，PCR和DNA探針技術有望不久成為病原診斷的實用方法。有一種叫做野外脈沖凝膠電泳的技術用于布氏菌病原鑒定，這種技術可以鑒別布氏菌各個種。PCR是用于鑒定布氏菌種型已是非常重要的工具，只需少量樣品即可在短時間內(nèi)得到結果， 基因指紋分析有助于流行病學研究和防控。對于布氏菌鑒定，基于PCR對方法比常規(guī)方法越來越實用，并且還在不斷發(fā)展成熟。然而，要想用于實驗室常規(guī)布氏菌病檢測，其敏感性、特異性、質量控制和質量保證還需用大量臨床樣品進行全面驗證。

（二）血清學診斷方法

1.凝集類試驗。傳統(tǒng)方法的凝集試驗（包括SAT、平板凝集試驗）在發(fā)達國家已基本上停止使用，取代的方法是緩沖布氏菌抗原試驗，包括卡片試驗、RBPT、緩沖平板凝集試驗。在國際貿(mào)易中，緩沖布氏菌抗原試驗是牛、羊、豬種布氏菌病診斷的指定試驗，作為篩選試驗用。

2.補體結合類試驗。CFT至今仍是布氏菌病的重要診斷方法，是牛、羊、綿羊副睪種布氏菌病診斷的國際貿(mào)易指定試驗，作為確診試驗用。但是，CFT不適合作為豬的個體診斷，因為豬的補體干擾豚鼠補體而使得試驗的敏感性降低。盡管如此，歐盟和其他一些國家還是強調，豬的補體結合試驗價低于20個國際單位。

最近，一種新的補體結合類試驗技術——補體結合酶聯(lián)免疫吸附試驗（CF- ELISA）技術得到研發(fā)，并且顯示出CFT的高特異性和ELISA的高敏感性，有望成為較理想的布氏菌病診斷技術。

（三）ELISA技術 ELISA是一種高敏感性的試驗，操作方便的診斷技術。不但可用于血清學診斷，還可用于乳汁等檢查。既可以作為確定試驗，又可以作為篩選試驗。但只有用于牛種布氏菌病的ELISA是國際貿(mào)易指定試驗。豬種布氏菌和綿羊副睪種布氏菌亦已有成熟的ELISA診斷技術。其它種布氏菌病上的應用還需進一步改進抗原和積累數(shù)據(jù)。

ELISA技術的特點是：（1）高敏感性，（2）用針對IgG類抗體的酶標二抗提高試驗點特異性。但由于此技術產(chǎn)品的質量控制較復雜，并且只檢測IgG類抗體，在臨床使用中還存在相當大的不穩(wěn)定性。

關于ELISA的研究報道相當多，表明這是一種大家認為比較有前途的診斷方法。ELISA的效果關鍵在于抗原的選用。在已經(jīng)標準化了的牛布氏菌病ELISA診斷中，使用了S-LPS抗原，以其為基礎建立的方法得到了普遍認可，也有用胞壁和胞質蛋白進行的ELISA，由于對這些蛋白在體液免疫反應中的情況了解不夠，其臨床價值還需大量的研究證實。

（四）其它血清學診斷技術 由于凝集試驗不適合綿羊副睪種布氏菌病的診斷，一種瓊脂凝膠免疫擴散(AGID)試驗就成為綿羊副睪種布氏菌病的常用診斷方法。但未被采納作國際貿(mào)易指定試驗。

對豬種布氏菌病來說，沒有一種傳統(tǒng)的血清學診斷方法是適用的，主要的問題在于斷奶后2～3個月齡的豬是最易感的，但他們對感染的凝集類抗體的應答很有限。再有，耶爾森氏菌O:9感染在豬非常普遍，而布氏菌傳統(tǒng)試驗所使用抗原的主要有效成分——LPS與耶爾森氏菌O:9的LPS難以區(qū)分。豬血清有時還有非特異抗體（主要是IgM），對凝集類試驗，尤其是SAT影響較大。因此，對豬布氏菌病的診斷，流行病學顯得尤為重要，貿(mào)易中應避免從疫區(qū)引進動物。變態(tài)反應試驗對豬種布氏菌病診斷有著很高的特異性，亦不與耶爾森氏菌發(fā)生交叉反應，但敏感性與凝集試驗一樣比較差，不適合作為個體豬的診斷。

（五）乳環(huán)試驗（MRT） 這個試驗依然是奶牛布氏菌病監(jiān)測的常用技術。對于混合牛奶，有用增加試驗牛奶樣品量來提高其敏感性的方法。也有用虎紅平板凝集試驗抗原稀釋法檢測牛奶中抗體滴度的方法。

三、疫苗免疫后布氏菌病的診斷

目前世界范圍內(nèi)廣泛應用的布氏菌病疫苗有2種，S19和Rev.1活疫苗。中國使用的疫苗有S2、M5、S(A)19活疫苗。這些疫苗都是光滑型布氏菌制備的，免疫后都產(chǎn)生干擾診斷羊種、牛種、豬種布氏菌感染的抗體。

自20世紀50年代開始，研究者為徹底解決疫苗免疫干擾診斷的問題，開始研究粗糙型布氏菌疫苗。報道實驗室試驗有效的不少于30種，從早期Jones等研制的R6、R7滅活佐劑疫苗，到后來的45/20滅活佐劑疫苗。最后都應免疫效果差或不是完全的無凝集原性而停止使用。上世紀90年代，美國研制出了一種粗糙型牛種布氏菌活疫苗RB51，據(jù)報道有相當于S19疫苗的免疫效力，同時不干擾常規(guī)血清學診斷，在美國已獲得政府批準正式使用。

另一類解決的方法是，通過控制免疫程序，降低和縮短疫苗免疫后的抗體反應程度。比較成功的程序有：（1）用S19疫苗免疫3～8月齡的犢牛，6個月后，其抗體水平已降低至診斷陽性標準以下，還可以用競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗（cELISA）進一步降低免疫抗體陽性反應的可能性。（2）用S2疫苗口服免疫，適用于牛、羊、豬，并且可保證畜群的高免疫密度。其免疫抗體的反應程度比S19免疫3～8月齡的犢牛還低，6個月后，其抗體水平已全部降低至診斷陽性標準以下。

綜上所述，在布氏菌病的診斷實踐中，科學準確地判定病畜和疫情，需要以標準方法為準繩，同時結合適用的新技術，可參考的技術，才能獲得理想的效果。

（略）