紀(jì)太旺，李志強(qiáng)，張 輝,2，張俊波，趙慶亮，王 浩，李 亞，王慧勤，陳創(chuàng)夫,2

羊種布氏菌043強(qiáng)毒株BRA0434基因缺失突變株的構(gòu)建與毒力的初步評(píng)價(jià)

紀(jì)太旺1，李志強(qiáng)1，張 輝1,2，張俊波1，趙慶亮1，王 浩1，李 亞1，王慧勤1，陳創(chuàng)夫1,2

目的 檢測(cè)BRA0434基因?qū)ρ蚍N布氏菌043毒力的影響。方法 利用同源重組的原理，以BRA0434基因外側(cè)的同源臂序列構(gòu)建重組質(zhì)粒，將其電轉(zhuǎn)化至布氏菌043感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)卡那抗性篩選和檢測(cè)引物鑒定而獲得羊種布氏菌043-ΔBRA0434缺失突變株，并以之和羊種布氏菌043以106CFU劑量腹腔接種小鼠，又以100∶1的感染復(fù)數(shù)侵染小鼠巨噬細(xì)胞。結(jié)果 與羊種布氏菌043相比，羊種布氏菌043-ΔBRA0434缺失突變株的載菌量和小鼠脾臟重量的影響都有一定程度的下降；侵染小鼠巨噬細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果顯示羊種布氏菌043-ΔBRA0434缺失突變株的毒力較羊種布氏菌043有所降低。結(jié)論 BRA0434基因的缺失會(huì)減輕羊種布氏菌043的毒力。

布氏菌；BRA0434基因；毒力；試驗(yàn)

ZHAO Qing-liang1,WANG Hao1,LI Ya1,WANG Hui-qin1,CHEN Chuang-fu1,2

布氏菌病(brucellosis)是最常見(jiàn)的一種細(xì)菌性人獸共患傳染病[1-3]，其病原屬于布氏菌屬，呈革蘭氏陰性，無(wú)芽孢，兼性細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌[4-6]。布氏菌的致病力主要表現(xiàn)在通過(guò)某些機(jī)制逃避或抑制巨噬細(xì)胞的殺菌作用，適應(yīng)胞內(nèi)環(huán)境并導(dǎo)致慢性感染[4-5]。慢性感染導(dǎo)致布氏菌擁有能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)生存的能力，如適應(yīng)宿主細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境，以及宿主正常的免疫防御[6-8]。

前期，研究發(fā)現(xiàn)在羊種布氏菌043強(qiáng)毒株與豬種布氏菌1330標(biāo)準(zhǔn)株的基因組DNA上有BRA0434基因的存在，而在豬種布氏菌S2菌苗株的基因組DNA上并沒(méi)有BRA0434基因的存在。為此，本研究以羊種布氏菌043為模板，構(gòu)建BRA0434基因缺失突變株，通過(guò)生長(zhǎng)特性檢測(cè)試驗(yàn)、侵染小鼠巨噬細(xì)胞試驗(yàn)以及動(dòng)物感染試驗(yàn)等方法評(píng)估其毒力下降程度，從而探討B(tài)RA0434基因在布氏菌毒力發(fā)揮過(guò)程中的作用，為進(jìn)一步研究該基因在布氏菌中的具體功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、載體、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞 羊布氏菌(B.melitensis，043) 是布氏菌強(qiáng)毒株，為本研究室保存；大腸桿菌(Escherichiacoli，DH5α)為本研究室保存；pMD18-T simple 載體購(gòu)自TaKaRa公司；pUC19K質(zhì)粒由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院疾病預(yù)防控制所陳澤良研究員饋贈(zèng)；6～8周齡昆明白雌性小鼠購(gòu)自石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7)購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞資源中心。

1.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以羊種布氏菌043的基因組DNA為模板，使用引物BRA0434-N-F和BRA0434-N-R高保真擴(kuò)增N端同源臂，使用引物BRA0434-N-F和BRA0434-N-R高保真擴(kuò)增C端同源臂；以pUC19K質(zhì)粒為模板，使用引物Kan-F和Kan-R高保真擴(kuò)增卡那霉素抗性基因。將得到的目的片段通過(guò)融合PCR的方法進(jìn)行融合之后直接與pMD18-T simple載體進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布于含有A+和K+抗性(氨芐青霉素和卡那霉素，50 mg/mL)的LB固體培養(yǎng)基，使用引物BRA0434-N-F和BA0434-C-R對(duì)陽(yáng)性單克隆菌落進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證。之后，將菌液PCR驗(yàn)證正確的菌株和重組質(zhì)粒送北京六合華大基因生物技術(shù)有限公司測(cè)序。所用引物和序列見(jiàn)表 1。

表1 引物和序列

1.3 羊種布氏菌043-ΔBRA0434缺失突變株的構(gòu)建和遺傳穩(wěn)定性檢測(cè) 序列測(cè)定正確后，將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入羊種布氏菌043的感受態(tài)細(xì)胞中，復(fù)蘇后涂布于含有K+的布氏菌固體培養(yǎng)基，37 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d，進(jìn)行抗性克隆的篩選與鑒定。首先，采用BRA0434基因的鑒定引物BRA0434-F和BRA0434-R對(duì)抗性克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定；其次，再采用位于BRA0434基因外側(cè)與卡那霉素抗性基因內(nèi)部的鑒定引物(BRA0434-I-F和Kan-I-R2引物組合；Kan-I-F2和BRA0434-I-R引物組合)對(duì)抗性克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定。將PCR鑒定正確的菌株繼續(xù)傳代培養(yǎng)至15代，檢測(cè)其遺傳穩(wěn)定性。所用鑒定引物和序列見(jiàn)表2。

1.4 生長(zhǎng)特性檢測(cè) 從布氏菌固體培養(yǎng)基上分別挑取羊種布氏菌043、羊種布氏菌043-ΔBRA0434的新鮮單克隆菌落，接種到新鮮的布氏菌液體培養(yǎng)基中，置37 ℃、180 r/min條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8，然后分別將搖好的菌液稀釋到OD600=0.1，置37 ℃、180 r/min條件下繼續(xù)進(jìn)行搖床振蕩培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中，每2 h取樣一次，每次取樣94 μL菌液，加入6～8 μL甲醛溶液，震蕩混勻，靜置滅活10 min后再檢測(cè)OD600的變化情況，直至細(xì)菌生長(zhǎng)速度進(jìn)入平臺(tái)期，并繪制羊種布氏菌043-ΔBRA0434和羊種布氏菌043的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

表2 鑒定引物和序列

1.5 動(dòng)物感染試驗(yàn) 將6～8周齡昆明白雌性小鼠隨機(jī)分成3組，每組24只。分別腹腔接種羊種布氏菌043、羊種布氏菌043-ΔBRA0434，接種劑量為1.0×106CFU/只，空白對(duì)照組注射無(wú)菌的PBS。在感染后的7 d、14 d、21 d和28 d的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每組隨機(jī)選取6只小鼠，斷頸處死小鼠，無(wú)菌條件下摘取小鼠脾臟并稱(chēng)重，用組織勻漿器充分碾碎脾臟后加入1 mL的PBS制成勻漿液。10倍系列稀釋勻漿液，取100 μL 涂板計(jì)數(shù)。

1.6 侵染小鼠巨噬細(xì)胞試驗(yàn) 將小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7)傳至六孔板中，培養(yǎng)至鋪滿(mǎn)六孔板底部，然后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。按照布氏菌與小鼠巨噬細(xì)胞的感染比例為100∶1的比例(MOI=100∶1)分別用羊種布氏菌043、羊種布氏菌043-ΔBRA0434侵染小鼠巨噬細(xì)胞。在侵染4 h、12 h、24 h和48 h的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，用 0.1%的 Tritonx-100裂解細(xì)胞。10倍系列稀釋后，取100 μL 涂板計(jì)數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以羊種布氏菌043為模板，擴(kuò)增出BRA0434基因的N端同源臂目的條帶大小為495 bp(圖 1A)；擴(kuò)增出BRA0434基因的C端同源臂目的條帶大小為526 bp(圖 1B)；以pUC19K質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增出卡那霉素抗性基因的目的條帶大小為1 093 bp(圖 1C)；融合PCR擴(kuò)增出的目的條帶大小為2 114 bp(圖 1D)；使用引物BR0524-N-F和BR0524-C-R對(duì)陽(yáng)性單克隆菌落進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，陽(yáng)性克隆菌能夠擴(kuò)增出的條帶大小為2 114 bp(圖 1E)；所得到的目的條帶大小均與設(shè)計(jì)的理論值相符。

A:1：BRA0434基因N端同源臂；2：陰性對(duì)照；M：DNA Marker;(A)BRA0434基因N端同源臂PCR擴(kuò)增

1: Flanking N of BRA0434; 2: Negative control; M：DNA Marker;(A) Flanking N of BRA0434 was amplified by PCR

B:1：BRA0434基因C端同源臂；2：陰性對(duì)照；M：DNA Marker;(B)BRA0434基因C端同源臂PCR擴(kuò)增

B:1: Flanking C of BRA0434; 2: Negative control; M：DNA Marker; (B) Flanking C of BRA0434 was amplified by PCR

1：卡那霉素抗性基因；2：陰性對(duì)照；M：DNA Marker；(C)卡那霉素抗性基因PCR擴(kuò)增

1: Kanamycin resistance gene; 2: Negative control; M: DNA Marker；(C) Kanamycin resistance gene was amplified by PCR.

1：融合PCR產(chǎn)物；2：陰性對(duì)照；M：DNA Marker；(D)BRA0434基因同源臂與卡那霉素抗性基因融合PCR擴(kuò)增

1: Products of fusion PCR; 2: Negative control; M: DNA Marker；(D) Homology arms of BRA0434 gene and kanamycin resistance gene were amplified by fusion PCR.

1：重組質(zhì)粒的菌液PCR產(chǎn)物；2：陰性對(duì)照；M：DNA Marker；(E)重組質(zhì)粒的菌液PCR鑒定

1: Products of recombinant plasmid PCR; 2: Negative control; M: DNA Marker；(E) Recombinant plasmid was identified by PCR.

圖1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

Fig.1 Construction of reconstruction plasmid

2.2 羊種布氏菌043-ΔBRA0434缺失突變株的鑒定與遺傳穩(wěn)定性檢測(cè) 采用BRA0434基因的鑒定引物BRA0434-F和BRA0434-R對(duì)抗性克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定之后，抗性克隆不能擴(kuò)增出BRA0434基因的全長(zhǎng)片段(1 335 bp)，而羊種布氏菌043親本株能夠擴(kuò)增出BRA0434基因的全長(zhǎng)片段(圖 2A)；同時(shí)，采用位于BRA0434基因的外側(cè)和卡那霉素抗性基因內(nèi)部的鑒定引物(BRA0434-I-F和Kan-I-R引物組合；Kan-I-F和BRA0434-I-R引物組合)對(duì)抗性克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定之后，抗性克隆能夠擴(kuò)增出預(yù)期大小的片段(分別為：1 040 bp和809 bp)，而羊種布氏菌043親本株不能擴(kuò)增出預(yù)期大小的片段(圖 2B、C)。這表明BRA0434基因的缺失突變株構(gòu)建正確，得到的重組菌株命名為043-ΔBRA0434。將043-ΔBRA0434連續(xù)傳代培養(yǎng)至15代，每一代都用BRA0434基因的鑒定引物BRA0434-F和BRA0434-R進(jìn)行菌液PCR鑒定，結(jié)果043-ΔBRA0434不能擴(kuò)增出BRA0434基因的全長(zhǎng)片段(1 335 bp)，而羊種布氏菌043親本株能夠擴(kuò)增出BRA0434基因的全長(zhǎng)片段，這表明043-ΔBRA0434缺失突變株遺傳性穩(wěn)定。

1：043-ΔBRA0434；2：羊種布氏菌043；M：DNA Marker；(A)BRA0434-F和BRA0434-R引物PCR鑒定043-ΔBRA0434

1: 043-ΔBRA0434; 2:B.Meilitensis043; M: DNA Marker；(A) PCR identification of 043-ΔBRA0434 by primers BRA0434-F and BRA0434-R

1：043-ΔBRA0434；2：羊種布氏菌043；M：DNA Marker；(B)BRA0434-I-F和Kan-I-R引物組合PCR鑒定043-ΔBRA0434

1: 043-ΔBRA0434; 2:B.Meilitensis043; M: DNA Marker；(B) PCR identification of 043-ΔBRA0434 by primers BRA0434-I-F and Kan-I-R

1：043-ΔBRA0434；2：羊種布氏菌043；M：DNA Marker；(C)Kan-I-F和BRA0434-I-R引物組合PCR鑒定043-ΔBRA0434

1: 043-ΔBRA0434; 2:B.Meilitensis043; M：DNA Marker；(C) PCR identification of 043-ΔBRA0434 by primers Kan-I-F and BRA0434-I-R.

圖2 羊種布氏菌043-ΔBRA0434 缺失突變株的鑒定

Fig.2 Identification of BRA0434 gene deficientB.melitensis043 stain

2.3 羊種布氏菌043-ΔBRA0434缺失突變株生長(zhǎng)特性檢測(cè) 體外培養(yǎng)的羊種布氏菌043-ΔBRA0434缺失突變株與其親本株羊種布氏菌043的生長(zhǎng)曲線(xiàn)結(jié)果表明(圖 3)，羊種布氏菌043-ΔBRA0434缺失突變株與其親本株羊種布氏菌043的的生長(zhǎng)曲線(xiàn)趨于一致，即差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 羊種布氏菌043-ΔBRA0434與羊種布氏菌043的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

Fig.3 Growth curve ofB.melitensis043-ΔBRA0434 andB.melitensis043 strains

2.4 動(dòng)物感染試驗(yàn) 在免疫后7 d、14 d、21 d和28 d的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每組取6只小鼠，斷頸處死小鼠，無(wú)菌摘取脾臟并稱(chēng)重，比較小鼠脾臟中細(xì)菌的載菌量變化情況以及脾臟重量的變化情況(圖 4)。脾臟CFU計(jì)數(shù)結(jié)果顯示：與羊種布氏菌043相比，羊種布氏菌043-ΔBRA0434缺失突變株的載菌量有一定程度的下降，且羊種布氏菌043-ΔBR0524缺失突變株對(duì)小鼠脾臟重量變化的影響也較羊種布氏菌043有所降低。

2.5 侵染小鼠巨噬細(xì)胞試驗(yàn) 以下為羊種布氏菌043-ΔBRA0434缺失突變株和羊種布氏菌043在4 h、12 h、24 h和48 h等不同時(shí)間點(diǎn)侵染小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7)的CFU計(jì)數(shù)詳情(圖 5)。結(jié)果顯示：羊種布氏菌043-ΔBRA0434缺失突變株的毒力較其親本株羊種布氏菌043有所下降，尤其是在染12 h的時(shí)候，其毒力下降較為明顯。

圖4 感染后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠脾臟載菌量變化(A)與脾臟重量變化(B)情況

Fig.4 Change of bacterial counts in the spleen (A) and weight profiles (B) after the infection ofBrucellaat different time points

圖5 043親本株和突變株胞內(nèi)存活實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

基因敲除是應(yīng)用DNA同源重組的基本原理所發(fā)展起來(lái)的一門(mén)新型的生物學(xué)技術(shù)，它是通過(guò)一定的途徑使機(jī)體特定的基因失活或者缺失的技術(shù)，即用設(shè)計(jì)的同源片段替代機(jī)體特定的靶基因片段，從而達(dá)到基因敲除的目的[12-13]。目前，該技術(shù)已經(jīng)成為一種比較理想的改造生物遺傳物質(zhì)的生物學(xué)技術(shù)，尤其是未知基因功能的探索[14]。本研究就是利用同源重組的基本原理構(gòu)建了羊種布氏菌043-ΔBRA0434缺失突變株，不同于傳統(tǒng)布氏菌缺失突變株構(gòu)建方法的是，本研究所采用的方法是以pMD18-T Simple載體為骨架來(lái)進(jìn)行重組質(zhì)粒的構(gòu)建，這在一定程度上避免了傳統(tǒng)方法中經(jīng)典自殺質(zhì)粒的整合所帶來(lái)的問(wèn)題(如構(gòu)建所需的時(shí)間較長(zhǎng)、分子操作需要在特殊的宿主菌體中來(lái)進(jìn)行、操作過(guò)程較為繁瑣、克隆的效率比較低等)；同時(shí)，還提供了一個(gè)不同于傳統(tǒng)方法中所選用的SacB篩選標(biāo)記，本研究以卡那霉素抗性基因作為篩選標(biāo)記，它能夠通過(guò)一次篩選就可得到目的基因的缺失突變株，而且，還能夠大大降低SacB所帶來(lái)的假陽(yáng)性檢出概率，進(jìn)而能夠大大提高布氏菌缺失突變株構(gòu)建的效率。

在本研究中，我們對(duì)羊種布氏菌043-ΔBRA0434缺失突變株與羊種布氏菌043親本株的生長(zhǎng)特性進(jìn)行了檢測(cè)，我們的研究結(jié)果表明BRA0434基因的缺失不會(huì)對(duì)羊種布氏菌043的生長(zhǎng)規(guī)律或者生長(zhǎng)狀態(tài)產(chǎn)生明顯的影響。通過(guò)采用侵染小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7)試驗(yàn)、動(dòng)物感染試驗(yàn)等方法初步探討了BRA0434基因?qū)ρ蚍N布氏菌043毒力的影響，我們的研究結(jié)果表明BRA0434基因的缺失則會(huì)對(duì)羊種布氏菌043毒力功能的發(fā)揮產(chǎn)生一定的影響。此外，經(jīng)Blasst等生物信息學(xué)方法分析，BRA0434基因?qū)儆诓际暇囊粋€(gè)假定的未知蛋白，可能具有結(jié)合陽(yáng)離子、參與碳水化合物代謝過(guò)程的功能。然而，若確定BRA0434基因在布氏菌中的具體功能，還需進(jìn)行進(jìn)一步的探索和研究。

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Chen Chuang-fu, Email: ccf-xb@163.com

Construction and preliminary evaluation of virulence of BRA0434 gene deficientBrucellamelitensis043 strain

JI Tai-wang1,LI Zhi-qiang1,ZHANG Hui1,2,ZHANG Jun-bo1,

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShiheziUniversity,Shihezi832003,China;2.Co-InnovationCenterforZoonoticInfectiousDiseasesintheWesternregion,Shihezi, 832003,China)

To study the influence of BRA0434 gene on the virulence ofBrucellamelitensis(B.melitensis) 043 strain, the BRA0434 gene recombinant plasmid was constructed by replacing BRA0434 gene with kanamycin resistance gene based on the method of homologous recombination, and it was transformed intoB.melitensis043 competent cells. The BRA0434 gene deficientB.melitensis043 strain (043-ΔBRA0434) were identified by using the kanamycin resistance screening and detection primers. TheB.melitensis043-ΔBRA0434 did not occur resilience mutation within 15 generations and genetic stability. We usedB.melitensis043-ΔBRA0434 andB.melitensis043 strains to infect mice and each mice was inoculated intraperitoneally (i. p.) with 106CFU) and murine macrophage (RAW264.7) (MOI=100∶1). Results showed that the microbial load quantity ofB.melitensis043-ΔBRA0434 has decreased to some extent compared withB.melitensis043 strain, and the effect on spleen weight of mice has also declined to some extent compared withB.melitensis043 strain. Results of the infection of murine macrophage (RAW264.7) experiments were also conveyed with animal infected test. These results indicated that the deficiency of BRA0434 gene could make some impact on the virulence ofB.melitensis043 strain.

Brucella; BRA0434 gene; virulence; test

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.08.011

國(guó)際科技合作項(xiàng)目(No.2013DFA32380), 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.31460650)資助，紀(jì)太旺與李志強(qiáng)同等貢獻(xiàn)

陳創(chuàng)夫，Email:ccf-xb@ 163. com

1.新疆石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子 832003； 2. 西部地區(qū)高發(fā)人獸共患傳染性疾病防治協(xié)同創(chuàng)新中心，石河子 832003

Supported by the International Science and Technology Cooperation Project of China (No. 2013DFR30970), and the National Natural Science Foundation of China (No. 31460650)

R378

A

1002-2694(2015)08-0737-05

2014-04-28；

2015-02-21