高 斌 ，宓 真，杜馨麗，車(chē)海龍

遼寧省糖尿病治療中心，遼寧沈陽(yáng) 110015

糖尿病仍屬終身疾病，傳統(tǒng)藥物治療難以阻止胰島β細(xì) 胞進(jìn)行性衰竭，患者終身依靠胰島素治療亦不能阻止并發(fā)癥的進(jìn)展。近年來(lái)的細(xì)胞移植治療，使得根治糖尿病有了新的曙光。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）能定向誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞，易于獲得及體外擴(kuò)增，可以解決臨床胰島細(xì)胞供體缺乏難題，并且避免移植物免疫排斥反應(yīng)、涉及的醫(yī)學(xué)倫理學(xué)及法律問(wèn)題[1]。但該研究尚處于初期階段，仍有許多問(wèn)題需要解決，本研究通過(guò)SD大鼠尾靜脈注射重組腺病毒-綠色熒光蛋白（Ad-GFP）病毒感染的BMSC，從生化檢測(cè)、病理及免疫組織化學(xué)觀察等方面初步探討了同種異體BMSC移植對(duì)糖尿病大鼠的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠 （清潔級(jí)），24只， 體重150～200g，2個(gè)月齡，室溫18～25℃，自然光照射，購(gòu)自沈陽(yáng)藥科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要試劑 鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ；美國(guó) sigma公司產(chǎn)品），DMEM-F12培養(yǎng)液 （Gibcol）， 胎牛清 （國(guó)產(chǎn)天津），Hanks液 （本實(shí)驗(yàn)室自己配制），消化液：0.25%胰蛋白酶＋0.02%EDTA 混合液（1∶1）；重組腺病毒 （Ad-GFP 上清）：北京諾賽基因組研究中心有限公司提供，血糖（葡萄糖氧化酶法，德國(guó) BIOSEN C-Line，Clinic），胰島素（放免試劑盒由北京北方生物技術(shù)研究所提供），糖化血紅蛋白 （HbA1c）測(cè)定：比色法，試劑盒為南京建成生物工程研究所提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 糖尿病模型建立和分組 大鼠禁食12 h（不禁水），以2%STZ溶液[臨用前低溫（0℃）以pH=4.2的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液配成]，45 mg/kg腹腔一次注射。造模后第7天乙醚輕度麻醉下采血（眶靜脈）測(cè)血糖。選血糖＞16.7 mmol/L 15只大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組：血糖（22.27±2.23）mmol/L，n=6；移植組：血糖（22.18±1.94） mmol/L，n=9。 造模前隨機(jī)抽取的5只正常對(duì)照組大鼠腹腔注射等量枸櫞酸鈉緩沖液。

1.2.2 骨髓液采集制備 正常SD大鼠經(jīng)20%烏拉坦5～9 ml/kg腹腔注射麻醉，無(wú)菌條件下摘取其兩側(cè)脛骨和股骨，用Hanks液（添加p 100 U/ml，s 100μg/ml）清洗兩遍。用咬骨鉗暴露骨髓腔，用注射器吸10 ml含10%胎牛血清DMEM-F12培養(yǎng)液，從骨髓腔沖洗出骨髓液，并收集。

1.2.3 BMSC培養(yǎng)擴(kuò)增[2]將收獲的骨髓打散成為細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心10 min，用含10%胎牛清DMEM-F12培養(yǎng)基重懸沉淀的細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度（3～5）×107接種于培養(yǎng)瓶中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱，100%濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)。48 h后首次全量換液，72h半量換液。以后每3～4天換液1次。7～10 d當(dāng)形成一些較大細(xì)胞克隆時(shí)，用Hanks液清洗培養(yǎng)物2次，加入消化液（0.25%胰蛋白酶＋0.02%EDTA混合液1∶1）數(shù)滴，置溫箱中消化，鏡下觀察細(xì)胞回縮，間隙增大時(shí)，加含10%胎牛血清DMEM-F12培養(yǎng)液停止消化。再按1∶3傳代接種到新培養(yǎng)瓶中，傳代后繼續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞再達(dá)80%～90%融合時(shí)，再行消化，獲得傳2代的BMSC。

1.2.4 GFP病毒感染傳代的BMSC[2]將傳2代獲得的BMSC每孔按2×105數(shù)量（2 ml）接種于 6孔板中。培養(yǎng) 72 h后，棄培養(yǎng)基，每孔加入Ad-EGFP的病毒上清并換含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況。1.2.5移植方法及相關(guān)檢測(cè) 經(jīng)篩選穩(wěn)定表達(dá)GFP的BMSC用于移植。移植組大鼠尾靜脈注射BMSC懸液0.4 ml，細(xì)胞數(shù)1×106～1×107/ml。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組及正常對(duì)照組大鼠尾靜脈注射生理鹽水。移植2周后采血測(cè)各組血糖、HbA1c、胰島素，并處死大鼠剖取胰腺，制作石蠟切片進(jìn)行胰島素免疫組化及冰凍切片熒光倒置顯微鏡直接觀察GFP表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠血糖、HbA1c、胰島素比較

實(shí)驗(yàn)2周，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組糖尿病大鼠血糖、HbA1c明顯高于正常對(duì)照組 （P＜0.001），胰島素明顯低于正常組 （P＜0.001）。移植組血糖、HbA1c低于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，其中HbA1c差異顯著（P＜0.05），胰島素高于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組（P＞0.05）。 見(jiàn)表 1。

表1 三組大鼠血糖、HbA1c和胰島素比較（x±s）

2.2 三組病理觀察

正常對(duì)照組大鼠胰島形態(tài)結(jié)構(gòu)一致，在胰腺腺泡之間可見(jiàn)散在分布的胰島，圓形或橢圓形,色淺，胰島細(xì)胞呈團(tuán)索狀分布，數(shù)量較多。免疫組化結(jié)果顯示，正常對(duì)照組胰島中心部胰島細(xì)胞的胰島素為強(qiáng)陽(yáng)性，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)深褐色粗大顆粒。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組胰島及胰島中心細(xì)胞數(shù)明顯減少。胰島素反應(yīng)基本陰性，僅見(jiàn)個(gè)別胰島細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)少量微弱淡黃色的細(xì)顆粒。移植組大鼠胰島中心部細(xì)胞增多，大部分胰島素反應(yīng)陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性呈黃色或褐色顆粒。胰腺外分泌組織可見(jiàn)表達(dá)GFP的細(xì)胞，胰島中未發(fā)現(xiàn)其表達(dá)。

3 討論

研究證實(shí)胰腺移植可有效緩解糖尿病[3]，但由于胰腺和胰島移植存在供體缺乏、免疫排斥反應(yīng)等難題，促使學(xué)者們將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到了能分化成胰島素分泌細(xì)胞的干細(xì)胞的研究上。

骨髓來(lái)源的干細(xì)胞在體外和體內(nèi)能分化為胰島素分泌細(xì)胞[4]。BMSC能定向誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞[5-6]，易于獲得及體外擴(kuò)增，可以解決臨床胰島細(xì)胞供體缺乏難題，并且避免移植物免疫排斥反應(yīng)、涉及的醫(yī)學(xué)倫理學(xué)及法律問(wèn)題。但該研究尚處于初期階段，仍有許多問(wèn)題需要解決，如分離純化問(wèn)題、尚缺乏行之有效的定向誘導(dǎo)分化方案、移植時(shí)機(jī)及移植后的安全性問(wèn)題等。由于誘導(dǎo)方法、條件、移植途徑不同，移植后對(duì)糖尿病大鼠治療結(jié)論不一[7-8]。BMSC直接移植入糖尿病大鼠體內(nèi)，能否分化為胰島β細(xì)胞，尚無(wú)結(jié)論性共識(shí)。有研究報(bào)道，BMSC移植能降低糖尿病大鼠血糖，升高血胰島素水平，組織學(xué)顯示有胰島再生，植入的BMSC在胰腺微環(huán)境發(fā)生遷移和再分布，向胰島β細(xì)胞方向分化[9]。

根據(jù)干細(xì)胞“歸巢”特性，BMSC會(huì)向病變處定向遷移。本研究采用大鼠骨髓體外貼壁分離培養(yǎng)、擴(kuò)增方法，獲取傳2代的BMSC，用GFP標(biāo)記，經(jīng)同種異體糖尿病大鼠尾靜脈直接移植治療2周，觀察靜脈移植BMSC對(duì)糖尿病大鼠的作用，移植途徑方便。本實(shí)驗(yàn)糖尿病模型是用STZ選擇性破壞胰島β細(xì)胞，使胰島素分泌減少，血糖升高。結(jié)果顯示移植組糖尿病大鼠血糖、HbA1c明顯下降，胰島素產(chǎn)生增加，胰島中心部細(xì)胞增多，大部分胰島素反應(yīng)陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性呈黃色或褐色顆粒。胰腺外分泌組織可見(jiàn)表達(dá)GFP的細(xì)胞，但胰島中未發(fā)現(xiàn)其表達(dá)，不除外實(shí)驗(yàn)手段的因素，關(guān)于BMSC在大鼠體內(nèi)遷移、分化，參與損傷胰島修復(fù)的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本研究提示同種異體BMSC經(jīng)尾靜脈直接移植可發(fā)揮有效的治療作用。與前述研究結(jié)果一致，可能通過(guò)內(nèi)源性胰島細(xì)胞增生發(fā)揮治療作用，為糖尿病細(xì)胞治療提供了新的途徑。

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