苗愛東 楊 靜 王彥宗

北京軍區(qū)聯(lián)勤部藥品儀器檢驗所，北京 100071

克拉霉素片為《中國藥典》2010年版二部收載品種[1]，屬大環(huán)內酯類藥物，臨床上常用于鼻咽感染、下呼吸道感染、皮膚軟組織感染、急性中耳炎、肺炎支原體肺炎、軍團菌感染、沙眼衣原體引起的尿道炎及宮頸炎等的治療[2]?？死顾仄暮繙y定方法為HPLC外標一點法[1]，本文根據(jù)《測量不確定度評定與表示》（JJFl059-1999）、《化學分析測量不確定度評定》（JJF1135-2005）和《化學分析中不確定度的評估指南》（CNAS-GL06：2006）中有關規(guī)定[3-5]，對HPLC法測定克拉霉素片含量的測量不確定度進行了評估，以期找出影響不確定度的各種因素，為客觀評價克拉霉素片的檢驗結果提供科學依據(jù)。

1 克拉霉素片的含量測定方法

1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以磷酸鹽緩沖液（pH 5.5）-乙腈（600∶400）為流動相；檢測波長為210 nm；柱溫45℃。理論板數(shù)按克拉霉素峰計算不低于3 000；拖尾因子不得過2.0；克拉霉素峰與相鄰雜質峰的分離度符合要求。

1.2 對照品溶液的配制

精密稱取克拉霉素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號130558-200902，純度97.9%）適量，置50 mL量瓶中，用流動相溶解并定量稀釋制成每毫升中約含0.35 mg的溶液。

1.3 供試品溶液的配制

取本品10片（麗珠集團麗珠制藥廠，0.25 g/片），精密稱定，研細，精密稱取細粉適量（約相當于克拉霉素35 mg）置100 mL量瓶中，加流動相充分振搖使溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

1.4 測定方法與數(shù)據(jù)分析

分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄對照品溶液和供試品溶液的峰面積，按外標法以色譜峰面積計算，即得[1]。實驗結果記錄見表1。

計算公式：X=〔（As×Wr×P×Vs×M） / （Ar×Vr×10×Ws×K標）〕×100%。式中：

X：克拉霉素的標示量（%）；

As：供試品溶液的峰面積；

Ar：對照品溶液的峰面積；

Wr：對照品稱樣量；

Ws：供試品稱樣量；

P：對照品的純度；

Vr：對照品稀釋倍數(shù)；

Vs：樣品稀釋倍數(shù)；

M：10片克拉霉素重量；

K標：克拉霉素片劑的標示量（0.25g）。

2 不確定度的量化分析

2.1 對照品引起的不確定度

2.1.1 對照品純度引起的相對不確定度 屬B類不確定度?？死顾貙φ掌酚芍袊幤飞镏破窓z定所提供，批號：130558-200902，純度97.9%，使用前無需干燥處理，未給出限度標識，其相對不確定度可視為0。

2.1.2 對照品稱量引起的相對不確定度 電子分析天平校準的不確定度分析：使用METTLER TOLEDO AG 285雙量程電子分析天平（d=0.01 mg），檢定證書列出的最大允差△為±0.03 mg，屬B類不確定度，按矩形分布，其標準不確定度為0.03/31/2=0.017 3 mg。

電子分析天平稱量重復性的不確定度分析：使用的電子分析天平（d=0.01 mg），檢定證書列出的重復性誤差為±0.05 mg，屬B類不確定度，按矩形分布，其標準不確定度為0.05/31/2=0.028 9 mg；單次稱量的標準不確定度為：（0.017 32+0.028 92）1/2=0.033 7 mg，因為稱量過程使用的是減重法，其不確定度為：（2×0.033 72）1/2=0.047 7 mg。

對照品雙樣稱量的相對標準不確定度分別為：0.047 7/18.45=2.59×10-3和0.074 8/16.86=2.83×10-3，故對照品稱量的相對標準不確定度為： [（2.59×10-3）2+（2.83×10-3）2]1/2=3.83×10-3。

表1 實驗結果記錄表

2.1.3 對照品稀釋引起的相對標準不確定度 查閱《常用玻璃量器檢定規(guī)程》JJG196-2006[6]，A級50 mL規(guī)格容量瓶的體積允差△為±0.05mL，屬B類不確定度，按三角分布，其相對不確定度為：0.05/（61/2×50）=4.08×10-4。

容量瓶體積重復性不確定度：對50 mL容量瓶加水至刻度后稱量，重復10次操作，得出的標準偏差為0.008 2 mL，屬A類不確定度，其相對不確定度為：0.082/50 =1.64 ×10-4。

溫差引起的不確定度：由玻璃儀器制造商提供的信息，50 mL容量瓶在20 ℃下校準，實驗室環(huán)境實測溫度為26 ℃，屬B類不確定度，按矩形分布，在95%置信概率下，其相對不確定度為：6×2.1×10-4×50/（31/2×50）=7.27×10-4。

對照品溶液稀釋引起的相對不確定度：[（4.08×10-4）2+（1.64×10-4）2+（7.27×10-4）2]1/2=8.50×10-4。

2.2 供試品引起的不確定度

2.2.1 供試品稱量引起的相對不確定度 電子分析天平校準的不確定度分析：使用的電子分析天平（d=0.01 mg），檢定證書列出的最大允差△為±0.03 mg，屬B類不確定度，按矩形分布，其標準不確定度為0.03/31/2=0.017 3 mg。

電子分析天平稱量重復性的不確定度分析：使用的電子分析天平（d=0.01 mg），檢定證書列出的重復性誤差為±0.05 mg，屬B類不確定度，按矩形分布，其標準不確定度為0.05/31/2=0.028 9mg。單次稱量的標準不確定度為：（0.017 32+0.028 92）1/2=0.033 7 mg，因為稱量使用的是減重法，其不確定度為：（2×0.033 72）1/2=0.047 7 mg。

供試品雙樣稱量的相對標準不確定度分別為0.047 7/63.70=7.49×10-4和0.047 7/63.50=7.51×10-4，故供試品稱量的相對標準不確定度為：[（7.49×10-4）2+（7.51×10-4）2]1/2=1.06×10-3。

2.2.2 供試品稀釋引起的相對標準不確定度 查閱《常用玻璃量器檢定規(guī)程》JJG196-2006[6]，A級100 mL規(guī)格容量瓶的體積允差△為±0.10 mL，屬B類不確定度，按三角分布，其相對不確定度為：0.10/（61/2×100）=8.16×10-4。

容量瓶體積重復性不確定度：對100 mL容量瓶加水至刻度后稱量，重復10次操作，得出的標準偏差為0.015 mL。屬A類不確定度，其相對不確定度為：0.015/100=1.50×10-4。

溫差引起的不確定度：由玻璃儀器制造商提供的信息，100 mL容量瓶在20℃下校準，實驗室環(huán)境實測溫度為26℃，屬B類不確定度，按矩形分布，在95%置信概率下，其相對不確定度為：（6×2.1×10-4×100）/（31/2×100）=7.27×10-4。

供試品溶液稀釋引起的相對不確定度：[（8.16×10-4）2+（1.50×10-4）2+（7.27×10-4）2]1/2=1.10×10-3。

2.3 對照品溶液進樣重現(xiàn)性的不確定度

精密稱取2份克拉霉素對照品，分別配成對照品溶液，每份溶液重復進樣3次，得到6個色譜峰面積數(shù)據(jù)，屬A類不確定度，為隨機測量，結果見表1。雙份對照品溶液各自的相對不確定度分別為 1.5/368.7=3.95×10-3和 1.2/333.6=3.58×10-3，故對照品溶液進樣的相對不確定度為[（3.95×10-3）2+（3.58×10-3）2]1/2=5.33×10-3。

2.4 供試品溶液進樣重現(xiàn)性的不確定度

精密稱取2份克拉霉素片供試品，分別配制成供試品溶液，每份溶液重復進樣2次，得到4個色譜峰面積數(shù)據(jù)，結果用極差法計算，取n=2時極差系數(shù)C=1.13，記錄雙樣測量峰面積為：356.7、358.5；351.3、350.8；則：S1=（356.7+358.5）/2=357.6，r=1.8；S2=（351.3+350.8）/2=351.1，r=0.5。

則相對標準不確定度為：{[1.8/（1.13×357.6）]2+[0.5/（1.13×351.1）2]}1/2=4.63×10-3。

2.5 平均片重稱量引入的不確定度

電子分析天平校準的不確定度分析：使用的電子分析天平（d=0.01 mg），檢定證書列出的最大允差△為±0.03 mg，屬B類不確定度，按矩形分布，其標準不確定度為0.03/31/2=0.017 3 mg。

電子分析天平稱量重復性的不確定度分析：使用的電子分析天平（d=0.01 mg），檢定證書列出的重復性誤差為±0.05 mg，屬B類不確定度，按矩形分布，其標準不確定度為0.05/31/2=0.028 9 mg。單次稱量的標準不確定度：（0.017 32+0.028 92）1/2=0.033 7 mg，因為稱量過程使用的是減重法，其不確定度為：（2×0.033 72）1/2=0.047 7 mg。

供試品平均片重稱量的相對標準不確定度為0.047 7/456.3=1.05×10-4。

2.6 不確定度各分量及分析

不確定度各分量及分析結果見表2。

表2 不確定度各分量的分析結果

2.7 合成相對標準不確定度

合成相對標準不確定度為：[（3.83×10-3）2+（8.50×10-4）2+（5.33×10-3）2+（1.06×10-3）2+（1.05×10-4）2+（1.10×10-3）2+（4.63×10-3）2]1/2=8.22×10-3。

合成標準不確定度為：8.22×10-3×100.1%=0.82%。

2.8 擴展不確定度

取包含因子k=2，則擴展不確定度為：2×0.82% =1.6%。

則克拉霉素片含量測定結果可表示為： 100.1%±1.6%， k=2。

3 討論

不確定度的評定是一份完整的藥品檢驗報告書應包括的內容，任何檢驗方法都不可避免地會引入不確定度。不確定度對檢測結果臨界值的判斷和檢驗方法的確認等具有十分重要的意義。由上述不確定度的分析評定結果可知，HPLC法測定克拉霉素片含量的不確定度主要來自液相色譜儀的進樣、對照品的稱量和供試品溶液的配制等環(huán)節(jié)，其中由對照品溶液和供試品溶液色譜分析進樣環(huán)節(jié)的不確定度之和占不確定度總和的60%，提示在采用HPLC法測定克拉霉素片的含量時，應確保液相色譜儀的技術性能指標與被測藥品的有關參數(shù)要求相適應，定期做好液相色譜儀的計量檢定和期間核查工作，使其始終處于良好穩(wěn)定的工作狀態(tài)；同時要嚴格按照藥典標準規(guī)定的要求取樣，選用精度符合要求的分析天平稱量，不能只為節(jié)約檢驗成本和操作方便而隨意減少對照品和供試品的取樣量，盡可能減少操作的隨意性和人為因素對檢驗結果造成的不利的影響。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：153.

[2]陳新謙，金有豫，湯光.新編藥物學（第15版）[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：89.

[3]JJF1135-2005.化學分析測量不確定度評定[S].北京：中國計量出版社，2005.

[4]JJFl059-1999.測量不確定度評定與表示[S].北京：中國計量出版社，1999.

[5]CNAS-GL06.化學分析中不確定度的評估指南[S].北京：中國計量出版社，2006.

[6]JJG196-2006.常用玻璃量器檢定規(guī)程[S].北京：中國計量出版社，2006.