李君豐，張叢堯，楊輝，王華，王偉

(1.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部海水增養(yǎng)殖學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023;2.遼寧省丹東市水產(chǎn)研究所，遼寧丹東118000)

仿刺參Apostichopus japonicus是中國(guó)記載的21種食用海參中唯一分布于黃渤海的溫帶種類，在連云港、山東半島、大連、北戴河等沿海均有分布，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，為“海產(chǎn)八珍”之一［1］。海洋生物對(duì) Zn(Ⅱ)的富集能力很強(qiáng)，海水中Zn(Ⅱ)濃度過(guò)高會(huì)對(duì)生物產(chǎn)生一定的毒害作用，影響其生長(zhǎng)和存活。仿刺參是重要的海洋經(jīng)濟(jì)物種，研究Zn(Ⅱ)對(duì)仿刺參的影響，對(duì)于改善養(yǎng)殖水環(huán)境，維持養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義［2］。

關(guān)于Zn(Ⅱ)對(duì)水生生物的毒性效應(yīng)及蓄積、分布和排放規(guī)律的研究報(bào)道較多［3－9］。隨著人們對(duì)仿刺參消費(fèi)量的增大，以仿刺參為研究對(duì)象的毒性試驗(yàn)、蓄積試驗(yàn)也越來(lái)越為廣大學(xué)者所關(guān)注［10－15］。已有的試驗(yàn)報(bào)道因試驗(yàn)生物暴露時(shí)間較短，多為急性毒性試驗(yàn)，而對(duì)于仿刺參幼參受Zn(Ⅱ)長(zhǎng)期脅迫的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)中，作者以仿刺參幼參為試驗(yàn)對(duì)象，探討在Zn(Ⅱ)慢性脅迫下，幼參體內(nèi)的Zn(Ⅱ)蓄積及對(duì)其生長(zhǎng)和存活的影響，旨在為仿刺參的養(yǎng)殖環(huán)境監(jiān)測(cè)、水質(zhì)管理和資源保護(hù)等提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)為重金屬污染水域的生物監(jiān)測(cè)及生態(tài)毒理學(xué)研究提供一定參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

仿刺參幼參取自大連金瑞水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司育苗場(chǎng)，體長(zhǎng)為(4.01±0.32)cm，體重為(2.002±0.210)g。試驗(yàn)前在水槽中暫養(yǎng)馴化7 d，每日全量換水，投喂適量配合飼料。試驗(yàn)時(shí)選擇刺突明顯、無(wú)化皮、無(wú)外傷、伸展自如的幼參隨機(jī)分組。

化學(xué)試劑ZnSO4·7H2O為國(guó)產(chǎn)分析純，試驗(yàn)前用雙蒸餾水配成50 mg/L的貯備液待用。

1.2 方法

試驗(yàn)設(shè)3個(gè)Zn(Ⅱ)濃度試驗(yàn)組和1個(gè)空白對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。根據(jù)適宜養(yǎng)殖的二類海水、毒物安全濃度海水和不宜養(yǎng)殖的三類海水中Zn(Ⅱ)的含量，將試驗(yàn)組Zn(Ⅱ)濃度設(shè)為0.050、0.150 mg/L［16］和 0.500 mg/L;空白對(duì)照組不加任何試劑，Zn(Ⅱ)濃度為自然海水中的本底值。試驗(yàn)采用以35 L水槽為飼養(yǎng)容器的靜水試驗(yàn)法［17］，每個(gè)水槽中飼養(yǎng)幼參50頭。試驗(yàn)期間遮光培養(yǎng)，間歇充氣，保持光照強(qiáng)度為40～400 lx，水溫為10～13℃，溶氧＞5.0 mg/L，pH為7.8～8.2，鹽度為30～31，自然海水中Zn(Ⅱ)本底值為0～0.54 μg/L。試驗(yàn)期間，每隔24 h全量換水1次，換水后定量加入貯備液，保持各試驗(yàn)組Zn(Ⅱ)濃度不變，投喂適量配合飼料。

暴露試驗(yàn)在大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部海水增養(yǎng)殖學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。樣品中Zn(Ⅱ)含量的測(cè)定在遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。暴露試驗(yàn)持續(xù)75 d，每隔25 d取樣 (即第25、50、75天)，測(cè)定幼參的體長(zhǎng)、體重及體內(nèi)Zn(Ⅱ)的含量，并計(jì)算此期間幼參的存活率、體長(zhǎng)增長(zhǎng)率、體重增長(zhǎng)率、Zn(Ⅱ)濃縮系數(shù)和蓄積速率。測(cè)定時(shí)，每組隨機(jī)取幼參6頭測(cè)量其體長(zhǎng)、體重，然后隨機(jī)取2頭于低溫 (50℃)下烘干，制成混合樣本后硝化，用原子吸收石墨爐法分析Zn(Ⅱ)含量。

有關(guān)計(jì)算公式如下:

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2003作初步處理，用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析法 (One－Way ANOVA Analysis)進(jìn)行顯著性分析，采用最小顯著差數(shù)法 (LSD)進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 Zn(Ⅱ)對(duì)仿刺參幼參生長(zhǎng)和存活的影響

通過(guò)75 d的暴露試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，除Zn(Ⅱ)濃度為0.500 mg/L的試驗(yàn)組幼參出現(xiàn)中毒、體長(zhǎng)萎縮外，其它各組幼參體長(zhǎng)持續(xù)增長(zhǎng)，體長(zhǎng)增長(zhǎng)率均達(dá)50%以上 (表1)。

表1 不同試驗(yàn)階段Zn(Ⅱ)對(duì)幼參體長(zhǎng)的影響Tab.1 Effect of Zn(Ⅱ)on body length in juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus

從表1可見(jiàn):空白對(duì)照組和0.050 mg/L濃度組的幼參體長(zhǎng)增長(zhǎng)情況基本相同，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)兩組幼參的體長(zhǎng)增長(zhǎng)率分別為 (60.34±17.11)%和(60.10±17.11)%;而0.150 mg/L濃度組幼參的體長(zhǎng)及增長(zhǎng)率雖然與前兩組無(wú)顯著差異 (P＞0.05)，但結(jié)果偏低，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)體長(zhǎng)增長(zhǎng)率為(50.37±6.29)%;0.500 mg/L濃度組從第25天開(kāi)始，幼參體長(zhǎng)顯著低于其它3組 (P＜0.05)，前50 d幼參生長(zhǎng)緩慢，在試驗(yàn)進(jìn)行到50～75 d時(shí)出現(xiàn)中毒現(xiàn)象，身體嚴(yán)重萎縮，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)體長(zhǎng)增長(zhǎng)率為 (－24.94±13.21)%。

從表2可見(jiàn):幼參在體重增長(zhǎng)率方面所表現(xiàn)出來(lái)的增長(zhǎng)規(guī)律與體長(zhǎng)增長(zhǎng)率的基本一致，但所不同的是0.150 mg/L濃度組從第50天開(kāi)始，幼參的體重就顯著低于空白對(duì)照組和0.050 mg/L濃度組(P＜0.05)，而試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，其體重增長(zhǎng)率僅為(100.949±40.471)%，雖然均低于空白對(duì)照組和0.050 mg/L濃度組，但差異均不顯著 (P＞0.05)。

表2 不同試驗(yàn)階段Zn(Ⅱ)對(duì)幼參體重的影響Tab.2 Effect of Zn(Ⅱ)in body weight of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus

圖1為Zn(Ⅱ)對(duì)幼參存活率的影響，可以看出:對(duì)照組、0.050 mg/L和0.150 mg/L濃度組幼參在暴露試驗(yàn)的75 d中均沒(méi)有出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，存活率為100%;而0.500 mg/L濃度組幼參在試驗(yàn)的前25 d中出現(xiàn)個(gè)別死亡現(xiàn)象，但無(wú)明顯中毒癥狀，其體長(zhǎng)、體重繼續(xù)增加，處于一個(gè)緩慢生長(zhǎng)的狀態(tài);試驗(yàn)進(jìn)行到25～50 d時(shí)，幼參活動(dòng)能力下降，吸附力減弱，死亡量繼續(xù)增加，存活率為(85.33±10.26)%;持續(xù)暴露50 d后，幼參大量死亡，且存活個(gè)體也出現(xiàn)體色發(fā)黑、身體細(xì)長(zhǎng)萎縮和體重減輕等明顯的中毒癥狀。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，幼參的存活率僅為 (38.67±15.53)%。

圖1 Zn(Ⅱ)對(duì)幼參存活率的影響Fig.1 Effect of Zn(Ⅱ)on survival rate in juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus

2.2 仿刺參幼參對(duì)Zn(Ⅱ)的蓄積

幼參對(duì)Zn(Ⅱ)的蓄積量與暴露時(shí)間、海水中Zn(Ⅱ)的濃度呈顯著正相關(guān) (P＜0.05)，即暴露時(shí)間越長(zhǎng)，海水中 Zn(Ⅱ)濃度越高，幼參對(duì)Zn(Ⅱ)的蓄積就越多。從表3可見(jiàn):在暴露試驗(yàn)的75 d中，包括空白對(duì)照組在內(nèi)的各試驗(yàn)組幼參體內(nèi)Zn(Ⅱ)含量均呈上升趨勢(shì)，但各Zn(Ⅱ)濃度試驗(yàn)組幼參在25、50、75 d時(shí)蓄積量均有顯著的差異 (P＜0.05)，而空白對(duì)照組在不同試驗(yàn)階段則無(wú)顯著差異 (P＞0.05);根據(jù)海水中Zn(Ⅱ)濃度的高低，Zn(Ⅱ)蓄積量和平均蓄積速率表現(xiàn)出相同的規(guī)律，空白對(duì)照組、0.050、0.150、0.500 mg/L濃度組試驗(yàn)結(jié)束時(shí)的蓄積速率分別為(0.4022±0.1260)、(1.0160±0.0215)、(1.3245±0.0807)、(2.8000±0.0185)mg/(g·d);而Zn(Ⅱ)濃縮系數(shù)則呈相反的規(guī)律，即海水中Zn(Ⅱ)濃度越高，濃縮系數(shù)越小，暴露于自然海水中的幼參 Zn(Ⅱ)濃縮系數(shù)為 ［(197.22±19.77) ×106］%，高于其它組幾個(gè)數(shù)量級(jí)。

從圖2可見(jiàn):在不同試驗(yàn)階段，空白對(duì)照組、0.050 mg/L和0.150 mg/L濃度組的蓄積速率較小且波動(dòng)平緩;而0.500 mg/L濃度組的蓄積速率波動(dòng)較大，第0～25天為4.5826 mg/(g·d)，第25～50天為0.6360 mg/(g·d)，第50～75天為3.1824 mg/(g·d)。在25～50 d這段時(shí)間里，由于Zn(Ⅱ)的長(zhǎng)期脅迫，Zn(Ⅱ)對(duì)幼參的毒性效應(yīng)已經(jīng)逐漸表現(xiàn)出來(lái)，在幼參緩慢生長(zhǎng)的同時(shí)蓄積速率也在減小，0.500 mg/L濃度組Zn(Ⅱ)的蓄積量只增加了0.159 mg/g，與空白對(duì)照組增加的0.157 mg/g十分接近;而50～75 d這段時(shí)間，0.500 mg/L濃度組幼參出現(xiàn)了明顯的中毒癥狀，蓄積量和蓄積速率快速升高。

圖2 仿刺參幼參對(duì)Zn(Ⅱ)的蓄積速率Fig.2 Accumulation rate in juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus

表3 不同試驗(yàn)階段幼參對(duì)Zn(Ⅱ)的蓄積量 (干重)、蓄積速率和濃縮系數(shù)Tab.3 Accumulation(dry matter)，accumulation rate and concentrated ratio of Zn(Ⅱ)in juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus

3 討論

3.1 Zn(Ⅱ)對(duì)仿刺參幼參生長(zhǎng)和存活的影響

試驗(yàn)期間幼參的體長(zhǎng)、體重及存活率的變化反映了在Zn(Ⅱ)長(zhǎng)期脅迫下幼參的生長(zhǎng)和存活情況，直觀地表現(xiàn)出幼參對(duì)Zn(Ⅱ)的耐受能力。孫振興等［12］在Zn(Ⅱ)對(duì)仿刺參幼參的急性毒性試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，Zn(Ⅱ)對(duì)幼參的毒性作用較為平緩持久，低濃度組隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，幼參出現(xiàn)陸續(xù)死亡的現(xiàn)象，存活個(gè)體大多活動(dòng)能力微弱、反應(yīng)遲緩，表明Zn(Ⅱ)對(duì)幼參具有持續(xù)的毒性效應(yīng)。方展強(qiáng)等［18］在重金屬對(duì)唐魚的急性毒性試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，Zn(Ⅱ)毒性較弱，經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)暴露時(shí)間唐魚才出現(xiàn)異常狀況。而本試驗(yàn)結(jié)果顯示，生活在自然海水(空白對(duì)照)、二類海水 (Zn(Ⅱ)濃度為0.050 mg/L)和Zn(Ⅱ)安全濃度海水 (Zn(Ⅱ)濃度為0.150 mg/L)中幼參的體長(zhǎng)、體重持續(xù)增長(zhǎng)，沒(méi)有表現(xiàn)出中毒和死亡的現(xiàn)象，但持續(xù)暴露在Zn(Ⅱ)安全濃度海水中的幼參體長(zhǎng)、體重的增長(zhǎng)情況不如自然海水和二類海水好，并隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng)表現(xiàn)出顯著差異 (P＜0.05)。說(shuō)明幼參在Zn(Ⅱ)安全濃度范圍內(nèi)的海水中可以生長(zhǎng)、存活，但安全濃度海水的Zn(Ⅱ)已經(jīng)對(duì)幼參的生長(zhǎng)產(chǎn)生了慢性的、持續(xù)的影響。生活在三類海水(Zn(Ⅱ)濃度為0.500 mg/L)中的幼參在試驗(yàn)初期，并沒(méi)有出現(xiàn)大量死亡的現(xiàn)象，但生長(zhǎng)緩慢，與其它試驗(yàn)組有顯著差異 (P＜0.05);但隨著暴露時(shí)間的持續(xù)，幼參出現(xiàn)中毒和大量死亡的現(xiàn)象。這說(shuō)明幼參在三類海水中可以生長(zhǎng)和存活一段時(shí)間，但隨著暴露時(shí)間的持續(xù)，Zn(Ⅱ)便會(huì)對(duì)幼參產(chǎn)生慢性的、持續(xù)的毒性效應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致幼參中毒及死亡。

3.2 仿刺參幼參對(duì)Zn(Ⅱ)的蓄積

幼參對(duì)Zn(Ⅱ)蓄積的試驗(yàn)結(jié)果顯示，幼參對(duì)Zn(Ⅱ)的蓄積量與暴露時(shí)間、Zn(Ⅱ)濃度呈顯著正相關(guān) (P＜0.05)，暴露在自然海水中的幼參對(duì)Zn(Ⅱ)的蓄積量也是持續(xù)升高的。這說(shuō)明在幼參的生長(zhǎng)過(guò)程中始終伴隨著對(duì)Zn(Ⅱ)的蓄積，空白對(duì)照組、0.050、0.150、0.500 mg/L濃度組幼參在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，Zn(Ⅱ)蓄積量分別為開(kāi)始時(shí)的1.4、2.0、2.3和3.8倍。軟體動(dòng)物由于具有高濾水速率及對(duì)重金屬較強(qiáng)的富集能力，而常被用于進(jìn)行重金屬水體的污染生物監(jiān)測(cè)研究。馬藏允等［19］認(rèn)為:海洋環(huán)境中污染物的濃度較低，與生物作用的時(shí)間較漫長(zhǎng)，研究在污染物濃度較低情況下生物的長(zhǎng)期累積效應(yīng)，對(duì)指示生物的選擇尤為重要。他在持續(xù)5個(gè)月對(duì)幾種大型底棲動(dòng)物積累重金屬的研究中發(fā)現(xiàn):櫛孔扇貝和菲律賓蛤?qū)n(Ⅱ)的耐受能力較差，而紫貽貝和褶牡蠣對(duì)Zn(Ⅱ)的耐受能力則較強(qiáng)，但兩者的積累規(guī)律不同。紫貽貝在Zn(Ⅱ)濃度較低時(shí)體內(nèi)蓄積量變化不大，在海水Zn(Ⅱ)濃度為1.00 mg/L時(shí)，開(kāi)始表現(xiàn)為積累而后逐漸死亡;褶牡蠣在體內(nèi)Zn(Ⅱ)含量本底水平就很高的情況下，蓄積量仍隨海水中Zn(Ⅱ)濃度的增加而增加。褶牡蠣對(duì)Zn(Ⅱ)的蓄積情況和本試驗(yàn)中幼參對(duì)Zn(Ⅱ)的蓄積情況相似。

Zn(Ⅱ)參與核酸和蛋白質(zhì)代謝，有促進(jìn)角質(zhì)生成、胃腸黏膜修復(fù)、增強(qiáng)機(jī)體免疫力和有利于精子生成等重要作用，也是酶 (特別是金屬酶)發(fā)揮作用不可或缺的因子［20］。幼參對(duì)Zn(Ⅱ)表現(xiàn)出很強(qiáng)的代謝調(diào)節(jié)能力。一方面，幼參對(duì)Zn(Ⅱ)的蓄積能力很強(qiáng)，暴露在自然海水中的幼參并沒(méi)有因?yàn)楹Ｋ休^低濃度的Zn(Ⅱ)而出現(xiàn)缺乏的癥狀;另一方面，暴露在二類海水中的幼參盡管對(duì)Zn(Ⅱ)的蓄積量和蓄積速率與空白對(duì)照組均有顯著差異 (P＜0.05)，但并沒(méi)因此出現(xiàn)對(duì)其生長(zhǎng)和生理功能的不良影響。這一點(diǎn)可以由兩組的濃縮系數(shù)清楚的表現(xiàn)出來(lái)，說(shuō)明在一定濃度范圍內(nèi)，幼參會(huì)根據(jù)自身生長(zhǎng)需要和耐受能力等情況對(duì)Zn(Ⅱ)進(jìn)行蓄積和排放調(diào)節(jié)，防止缺乏或中毒現(xiàn)象的發(fā)生。吳堅(jiān)［21］和 Roesijadi［22］的研究表明，軟體動(dòng)物的解毒機(jī)制在于其體內(nèi)金屬硫蛋白的作用，而重金屬能誘導(dǎo)體內(nèi)金屬硫蛋白的合成，其作用是調(diào)節(jié)重金屬在體內(nèi)的平衡。筆者認(rèn)為，幼參對(duì)Zn(Ⅱ)的代謝調(diào)節(jié)很可能與體內(nèi)金屬硫蛋白的調(diào)節(jié)作用有關(guān)，其機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究。

王志錚等［23］在對(duì)黃姑魚幼魚的急性毒性試驗(yàn)中提出，當(dāng)生物受到重金屬離子如Hg(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)、Cr(Ⅵ)等污染時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)其體內(nèi)合成一定數(shù)量的金屬結(jié)合蛋白 (MT)，而當(dāng)這些重金屬離子在生物體內(nèi)積累到一定程度以后，進(jìn)入細(xì)胞的金屬離子超過(guò)生物合成MT速率對(duì)它的需求時(shí)，多余的金屬離子就會(huì)與其體內(nèi)的其它生物分子，包括酶和核酸等大分子相互作用，引起中毒現(xiàn)象。暴露在三類海水中的幼參蓄積速率波動(dòng)較大，在25～50 d這段時(shí)間里，幼參受Zn(Ⅱ)的長(zhǎng)期脅迫，體內(nèi)蓄積了大量Zn(Ⅱ)，幼參為抑制中毒現(xiàn)象的產(chǎn)生而進(jìn)行積極的代謝調(diào)節(jié)，消耗大量的能量，這可能是此期間幼參生長(zhǎng)緩慢、蓄積速率減小的原因。但隨著持續(xù)暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，幼參對(duì)Zn(Ⅱ)的蓄積量已經(jīng)超出了其耐受能力，因而出現(xiàn)明顯的中毒癥狀;其體內(nèi)Zn(Ⅱ)的蓄積量和蓄積速率的快速升高，也說(shuō)明幼參自身的調(diào)節(jié)能力喪失，已經(jīng)蓄積的Zn(Ⅱ)并沒(méi)有及時(shí)排出體外。

本試驗(yàn)中采用Zn(Ⅱ)的安全濃度為0.150 mg/L，高于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn) (GB11607－1989)［24］規(guī)定的0.100 mg/L。結(jié)果表明，在0.150 mg/L Zn(Ⅱ)的長(zhǎng)期脅迫下，幼參的生長(zhǎng)情況已經(jīng)受到了影響。這種慢性的、持續(xù)的影響會(huì)對(duì)幼參帶來(lái)多大的危害，能否引起幼參的中毒現(xiàn)象，還需要進(jìn)一步試驗(yàn)研究。在75 d的暴露試驗(yàn)期間，幼參本身處于一個(gè)有機(jī)物積累且快速生長(zhǎng)的階段，這可能與各組Zn(Ⅱ)的蓄積量逐漸增加有關(guān)。幼參對(duì)Zn(Ⅱ)的耐受和調(diào)節(jié)能力會(huì)隨著個(gè)體的逐漸成熟而有所變化，至于成體仿刺參對(duì)Zn(Ⅱ)的蓄積情況還需要更多的試驗(yàn)研究。另外，國(guó)家食品中鋅限量衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn) (GB13106－1991)［25］中雖然沒(méi)有關(guān)于仿刺參的限量規(guī)定，但對(duì)魚類中鋅含量的規(guī)定是不高于50 mg/kg。從本試驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，即便生活在自然海水中的幼參，Zn(Ⅱ)在其干重中的含量也高于這個(gè)限量，所以仿刺參的食品安全問(wèn)題也是值得特別關(guān)注的。

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