李斌，何俊鋒，區(qū)小玲，蘇翔駒，潘英，羅福廣，鄭惠芳，覃志彪

(廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530004)

施氏獺蛤Lutraria siebaldii隸屬軟體動物門Mollusca、瓣鰓綱Lamillibranchia、異齒亞綱Heterodonta、簾蛤目Veneroida、蛤蜊科Mactridae、獺蛤亞科Lutrariinae H et A Adams、獺蛤?qū)貺utraria，在中國主要分布于廣西、廣東、福建及海南沿海，以北部灣數(shù)量居多，是北部灣沿海特有的一種經(jīng)濟(jì)雙殼類水產(chǎn)品［1］。施氏獺蛤呈橢圓形，其殼長為10.0～12.0 cm，廣西沿海俗稱象鼻螺、牛螺，廣東稱包螺。近年來，依靠天然苗種且通過海上圈養(yǎng)，施氏獺蛤已成為廣西、廣東沿海淺海增養(yǎng)殖的主要種類之一。目前，在廣西施氏獺蛤生產(chǎn)性人工育苗已成功，灘涂養(yǎng)殖正逐步走向規(guī)?；５捎跒E捕，施氏獺蛤產(chǎn)量急劇下降，且由于不同來源的同種材料難以從外觀、形態(tài)上加以區(qū)別，給施氏獺蛤的推廣養(yǎng)殖帶來一定困難。因此，有必要建立有效的分子標(biāo)記鑒定方法和認(rèn)證特征，以防止在生產(chǎn)上發(fā)生種質(zhì)與種苗的“混亂”。

有關(guān)獺蛤的研究大多集中在形態(tài)發(fā)育、生態(tài)學(xué)、核型分析、營養(yǎng)成分等方面［2－7］，而關(guān)于遺傳背景的研究卻很少，目前對施氏獺蛤的DNA水平的研究國內(nèi)外尚未見報道。本研究中，作者以產(chǎn)自廣西和廣東兩省區(qū)的3個施氏獺蛤自然群體為試驗(yàn)對象，結(jié)合形態(tài)特征分析與核基因DNA的RAPD標(biāo)記，對其遺傳多樣性進(jìn)行分析，旨在為系統(tǒng)研究施氏獺蛤遺傳資源，以制定相應(yīng)的資源保護(hù)措施提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

施氏獺蛤分別取自中國廣西北海 (BH)、防城(FC)和廣東湛江 (ZJ)，共115個樣本，采用越南廣寧 (VIE)的大獺蛤30個樣本作外參對照，具體情況見表1。

表1 材料來源Tab.1 Sampling location and time

1.2 方法

本試驗(yàn)中分別采用形態(tài)測量分析和RAPD分子標(biāo)記兩種方法對施氏獺蛤3個自然群體的遺傳多樣性進(jìn)行了分析。

1.2.1 形態(tài)指標(biāo)及測定 對施氏獺蛤3個群體和大獺蛤1個群體共145個樣品的形態(tài)指標(biāo)進(jìn)行測量，分別測量殼高 (SH)、殼長 (SL)、殼寬(SW)、殼頂?shù)奖尘壡岸?(DUA)、前閉殼肌高(HAR)、前閉殼肌寬 (WAR)、后閉殼肌高 (HPR)、后閉殼肌寬 (WPR)、主齒寬 (WT)、主齒到外套線邊緣距離 (DTL)、外套線到殼腹緣距離 (DPM)、體質(zhì)量 (W)和軟體部質(zhì)量 (R)13個形態(tài)指標(biāo)，共測得數(shù)據(jù)2250個。貝殼測量部位見圖1，參照Kong等［8］的測量方法。

圖1 施氏獺蛤的形態(tài)測量Fig.1 Morphologic measurements of L.siebaldii

1.2.2 DNA的提取 參照尤仲杰等［9］的方法，根據(jù)實(shí)際需要略有改動。取50 mg肌肉組織，剪碎后放入1.5 mL滅菌EP管中，加入520 μL STE溶液和60 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的SDS，震蕩混勻后再加入20 μL蛋白酶K(10 mg/mL)，于56℃下消化過夜;用 φ(酚)∶φ(氯仿)∶φ(異戊醇)=50 ∶49 ∶1和φ(氯仿)∶φ(異戊醇)=24∶1的混合液抽提兩次，加入2倍體積的冰凍無水乙醇，顛倒搖動數(shù)次至DNA呈絮狀析出，于－20℃下冰凍30 min以上;將管內(nèi)液體小心倒出，加入預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇洗滌兩次，將附著有DNA的EP管置于空氣中自然風(fēng)干，向管中加入50 μL TE緩沖液，置于冰箱 (4℃)中保存。

1.2.3 隨機(jī)引物及RAPD反應(yīng) 試驗(yàn)所用的20個隨機(jī)引物是從100個引物中篩選出的，引物序列見表2。試驗(yàn)前進(jìn)行條件優(yōu)化，最終確定反應(yīng)條件為:反應(yīng)體系為 25 μL，10×buffer 2.5 μL，dNTPs 1.0 μL，primer 1.0 μL，DNA 模板 2.0 μL，Taq 酶0.3 μL(5 U/μL)，ddH2O 18.2 μL。RAPD 擴(kuò)增程序?yàn)?94℃下預(yù)變性4 min;94℃下變性1 min，36℃下退火3 min，72℃下延伸2 min，共進(jìn)行44個循環(huán);最后在72℃下再延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用20 g/L的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，在紫外凝膠系統(tǒng)下觀察并拍照。

表2 隨機(jī)引物的編號及序列Tab.2 The numbers and sequences of random primers

1.3 數(shù)據(jù)處理

形態(tài)差異分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包的聚類分析 (CA)、主成分分析 (PCA)、判別分析(DA)3種多元分析方法，分別對施氏獺蛤3個群體和大獺蛤1個群體的12個形態(tài)比例性狀進(jìn)行單因子方差分析 (ANOVA)。

根據(jù)電泳凝膠的擴(kuò)增條帶，以1、0表示擴(kuò)增條帶有無，形成0、1矩陣，將結(jié)果輸入Popgen 32軟件，統(tǒng)計擴(kuò)增結(jié)果。多態(tài)位點(diǎn)百分率P是反映群體內(nèi)變異水平的重要指標(biāo)之一，其計算公式為

其中:k為多態(tài)位點(diǎn)數(shù)目;n為所測定位點(diǎn)的總數(shù)。

種群內(nèi)和種群間的遺傳相似性和遺傳距離根據(jù)Nei等［10］的公式計算:

其中:Nx表示樣品x具有的條帶數(shù);Ny表示樣品y具有的條帶數(shù);Nxy表示樣品x和y的共有條帶數(shù)。

用Shannon遺傳多樣性指數(shù)表示群體的遺傳多樣性，根據(jù)Luciane等［11］的方法，計算公式為

其中:H0表示全部引物所檢測到的該群體中所有位點(diǎn);πi表示某位點(diǎn)在群體中的類型頻率。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)差異分析結(jié)果

2.1.1 形態(tài)特征參數(shù)分析 施氏獺蛤3個群體和大獺蛤1個群體的形態(tài)特征描述性統(tǒng)計值見表3。

表3 施氏獺蛤3個群體和大獺蛤1個群體形態(tài)特征的描述性統(tǒng)計值Tab.3 A descriptive statistics on morphological characters from different populations of Lutraria siebaldii and Lutraria maxima

2.1.2 聚類分析 對施氏獺蛤3個群體和大獺蛤1個群體所有樣本的12個性狀形態(tài)矯正值進(jìn)行種內(nèi)和種間聚類分析結(jié)果見圖2。施氏獺蛤3個群體中，北海與防城群體首先聚為一類，然后再與湛江群體聚為一個整體。

圖2 施氏獺蛤3個群體和大獺蛤1個群體的聚類分析圖Fig.2 Diagram of cluster analysis from different populations of Lutraria siebaldii and Lutraria maxima

種間比較，施氏獺蛤湛江群體與北海群體距離最短，形態(tài)最為接近，最先聚為一類，然后防城群體與前者趨異程度增加再聚成一類;而越南大獺蛤群體與施氏獺蛤3個群體趨異程度最大，作為外群的越南大獺蛤群體自成一支。

2.1.3 主成分分析 對施氏獺蛤3個群體和大獺蛤1個群體的12個性狀形態(tài)矯正值進(jìn)行主成分分析，獲得3個主成分。3個主成分的負(fù)荷值和方差貢獻(xiàn)率見表4。3個主成分的累積貢獻(xiàn)率較高，說明這3個相互獨(dú)立的因子適合概括不同群體之間的形態(tài)差異。

施氏獺蛤3個群體和大獺蛤1個群體的第一、第二主成分散布圖見圖3。從圖3可以看出:施氏獺蛤3個群體重疊比較嚴(yán)重，說明3個群體差異較小;而越南大獺蛤群體與3個施氏獺蛤群體的形態(tài)差異較大，已分化形成兩個不同的種，這與聚類分析的結(jié)果相一致。

2.1.4 判別分析 對施氏獺蛤3個群體和大獺蛤1個群體的12個性狀形態(tài)矯正值用F檢驗(yàn)進(jìn)行判別分析，判別效果較好 (P＜0.01)，說明施氏獺蛤和大獺蛤不同群體間形態(tài)差異明顯。

圖3 施氏獺蛤3個群體和大獺蛤1個群體的主成分散布圖Fig.3 Scattering diagram of the principal components from different populations of Lutraria siebaldii and Lutraria maxima

通過逐步判別法分析，建立施氏獺蛤3個群體和大獺蛤1個群體的判別函數(shù)。為了消除樣本大小對形態(tài)度量指標(biāo)的影響，度量指標(biāo)除以殼長作為判別的特征值外，公式中的 X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12分別代表 SW/SL、SH/SL、 WT/SL、 HAR/SL、 WAR/SL、 HPR/SL、WPR/SL、 DTL/SL、 DPM/SL、 lnW/lnSL、 lnR/lnSL、DUA/SL12個性狀形態(tài)矯正值，施氏獺蛤3個群體和大獺蛤1個群體的判別函數(shù)中的自變量系數(shù)和常數(shù)項見表5，其判別公式如下:

表4 施氏獺蛤3個群體和大獺蛤1個群體12個性狀的3個主成分的貢獻(xiàn)率及負(fù)荷值Tab.4 Contribution ratios and loading of three principal components for twelve characters from different populations of Lutraria siebaldii and Lutraria maxima

將12個矯正值分別代入上面的判別函數(shù)中，比較函數(shù)值的大小，被判別的個體歸屬于函數(shù)值最大的函數(shù)所對應(yīng)的群體。為檢驗(yàn)判別函數(shù)的應(yīng)用效果，對施氏獺蛤3個群體和大獺蛤1個群體的145個樣本按判別函數(shù)進(jìn)行預(yù)測分類，判別分析結(jié)果見表6，表明判別函數(shù)是可靠的。

表5 施氏獺蛤3個群體和大獺蛤1個群體形態(tài)判別函數(shù)的各項系數(shù)及常數(shù)項Tab.5 Coefficients and constant of discriminant functions from different populations of Lutraria siebaldii and Lutraria maxima

2.2 RAPD擴(kuò)增結(jié)果

本試驗(yàn)中用篩選所得的20條引物對施氏獺蛤3個群體和大獺蛤1個群體共145個樣品進(jìn)行多態(tài)性分析，共獲得428條清晰的條帶，對單個引物擴(kuò)增出6～17條帶，引物擴(kuò)增的片段大小為125～5000 bp，其中引物S176－200、S30－150僅在北海施氏獺蛤群體中出現(xiàn)，S469－200只在防城施氏獺蛤群體中出現(xiàn)，S30－300僅在湛江施氏獺蛤群體出現(xiàn)，而S474－3000、S1451－2000、S30－1100、S176－850僅在越南大獺蛤群體中出現(xiàn)。用以上8條引物可以區(qū)分施氏獺蛤3個群體和大獺蛤1個群體，作為群體的特征標(biāo)記。用引物S176對施氏獺蛤3個群體和大獺蛤1個群體的RAPD擴(kuò)增結(jié)果見圖4。

表6 施氏獺蛤3個群體和大獺蛤1個群體判別分析結(jié)果Tab.6 Discriminant results from different populations of Lutraria siebaldii and Lutraria maxima

分別統(tǒng)計施氏獺蛤3個群體和大獺蛤1個群體RAPD擴(kuò)增結(jié)果，用Popgen 32軟件計算各個群體的多態(tài)位點(diǎn)率、遺傳分化系數(shù)、香農(nóng)多樣性指數(shù)(表7)，并根據(jù)遺傳分化指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)估算出種群間的遺傳多樣性和分化 (表8)。從表7、8可知，各組數(shù)據(jù)較一致地反映出施氏獺蛤3個群體和大獺蛤1個群體都具有較豐富的遺傳多樣性，其中從香農(nóng)指數(shù)和遺傳分化指數(shù)上來看，北海施氏獺蛤群體最為豐富。利用 Nei等［12］無偏法 (Unbiased measure)計算群體內(nèi)和群體間的遺傳距離及遺傳相似性指數(shù) (表9)，結(jié)果表明:施氏獺蛤3個群體之間的遺傳相似性指數(shù)為0.8304～0.8378;3個群體間的遺傳距離為0.1770～0.1859，其中，湛江和防城群體遺傳距離最大 (0.1859)，而北海與防城群體間遺傳距離最小 (0.1770)，說明施氏獺蛤群體間存在著一定的遺傳差異，并且差異顯著，具有明顯的地理種群特征。對施氏獺蛤3個群體和大獺蛤1個群體進(jìn)行UPGMA聚類分析，構(gòu)建的分子系統(tǒng)樹見圖5。

遺傳距離和聚類分析的結(jié)果表明，在施氏獺蛤群體內(nèi)，北海與防城群體最先聚為一類，然后再與湛江群體聚為一個整體;在種間聚類分析中，施氏獺蛤群體內(nèi)的北海與防城群體先聚，再與湛江群體相聚，最后才與越南大獺蛤群體聚為一個整體。

表7 施氏獺蛤3個群體和大獺蛤1個群體RAPD標(biāo)記分析結(jié)果Tab.7 RAPD results from different populations of Lutraria siebaldii and Lutraria maxima

表8 施氏獺蛤3個群體和大獺蛤1個群體種群內(nèi)、種群間遺傳多樣性及分化Tab.8 Genetic diversity and differentiation in/among different populations of Lutraria siebaldii and Lutraria maxima by Shannon's index and Nei's gene diversity

3 討論

近年來，采用形態(tài)分析和分子遺傳標(biāo)記進(jìn)行海洋貝類種質(zhì)資源遺傳分析的研究較為廣泛［8－9］，但有關(guān)施氏獺蛤群體遺傳的研究尚未見報道。本研究中，作者采用形態(tài)測量分析和RAPD分子標(biāo)記兩種方法對廣西和廣東沿海施氏獺蛤3個地理群體的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，所得結(jié)果基本一致，均較好地反映出施氏獺蛤3個群體和大獺蛤1個群體的親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近程度及遺傳多樣性的豐富程度。但同時也表明這兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，只有將兩種方法有機(jī)地結(jié)合起來，才能得出更加可信的試驗(yàn)結(jié)果。

3.1 應(yīng)用多元分析法對數(shù)量性狀的分析

圖4 引物S176對施氏獺蛤3個群體和大獺蛤1個群體RAPD擴(kuò)增圖譜Fig.4 RAPD amplification profiles by primer S176 from different populations of Lutraria siebaldii and Lutraria maxima

在形態(tài)分析中，聚類分析可將不同種群進(jìn)行初步歸類，量化種群間的差異程度，分析種群間的相似程度［13］，所得出的種群間的相似程度與種類親疏和地理距離的遠(yuǎn)近有關(guān)。如本研究中，地理距離較近的北海、防城群體首先相聚，再與湛江群體相聚，最后才與越南群體相聚。主成分分析中，第1主成分主要反映殼高數(shù)據(jù)，第2主成分的體質(zhì)量和去殼質(zhì)量，間接反映殼厚，表明貝殼的形狀和厚度是區(qū)分施氏獺蛤不同地理群體的主要因素，這在對其它貝類的研究中也同樣得到證實(shí)［14］。從判別分析結(jié)果來看，因?yàn)樵侥洗螳H蛤群體與施氏獺蛤3個群體之間屬于種間判別，所以對越南群體的判別準(zhǔn)確率較高。采用3種多元分析方法得到施氏獺蛤3個群體和大獺蛤1個群體的遺傳多樣性分析結(jié)果較一致，說明這3種方法在一定程度上可以區(qū)分施氏獺蛤不同地理群體。但由于自然和人為因素對貝類的外部形態(tài)影響較大，在種類鑒定、遺傳分析等方面往往會存在一定誤差。所以，只有將形態(tài)指標(biāo)與生化、分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合起來，才能更準(zhǔn)確地描述施氏獺蛤各群體間的特性。

表9 施氏獺蛤3個群體和大獺蛤1個群體的遺傳相似性(上三角)和遺傳距離 (下三角)Tab.9 Nei's genetic identity(above diagonal)and genetic distance(below diagonal)of different populations of Lutraria siebaldii and Lutraria maxima

圖5 施氏獺蛤3個群體和大獺蛤1個群體的UPGMA聚類圖Fig.5 UPGMA clustering of different populations of Lutraria siebaldii and Lutraria maxima

3.2 施氏獺蛤的遺傳多樣性

遺傳多樣性是生物所攜帶的遺傳信息的總和。采用RAPD技術(shù)對施氏獺蛤3個群體和大獺蛤1個群體的樣品進(jìn)行研究，共獲得428條帶、925個位點(diǎn)，每條引物擴(kuò)增出條帶6～17條，平均每條引物擴(kuò)增出11.56個位點(diǎn)，片段大小為125～5000 bp。對施氏獺蛤3個群體和大獺蛤1個群體共擴(kuò)增出多態(tài)位點(diǎn)785個，多態(tài)位點(diǎn)比例平均為84.9%。較高的多態(tài)位點(diǎn)比例表明，施氏獺蛤3個群體具有豐富的遺傳多樣性。目前國內(nèi)施氏獺蛤的養(yǎng)殖還處于起步階段，尚未形成規(guī)?；B(yǎng)殖，養(yǎng)殖群體未對野生群體造成影響，施氏獺蛤遺傳多樣性仍處于較高的水平，而不同地理種群間遺傳多樣性差異與施氏獺蛤的地理分布特點(diǎn)有著密切關(guān)系。

遺傳多樣性的豐富程度受到繁育系統(tǒng)和分布范圍的影響，遠(yuǎn)交或分布范圍較廣的物種遺傳多樣性水平較高，反之較低。RAPD研究結(jié)果表明，施氏獺蛤3個群體和大獺蛤1個群體的Shannon指數(shù)及Nei指數(shù)與檢測到的遺傳多樣性一致，遺傳多樣性由低到高依次為越南群體＜湛江群體＜防城群體＜北海群體，表明施氏獺蛤3個群體的遺傳多樣性水平較高。

3.3 遺傳距離和親緣關(guān)系的比較

遺傳距離是評價群體遺傳變異水平的重要指標(biāo)，同樣能反映出群體間遺傳多樣性的豐富程度。Thorpe［15］認(rèn)為，同科屬間遺傳距離 (D)為0.5～0.9，同屬種間D為0.2～0.8，同種種群間D為0.03～0.2。群體間遺傳相似度與遺傳距離指數(shù)能反映群體間的親緣關(guān)系。本研究中，施氏獺蛤3個群體間的遺傳相似度為0.8304～0.8378，遺傳距離為0.1770～0.1859，防城與北海群體的親緣關(guān)系較近，與湛江群體親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。施氏獺蛤群體間的遺傳距離隨著地理位置的距離增加而逐漸加大，遺傳差異也較大。施氏獺蛤湛江、北海、防城群體間的遺傳距離為0.03～0.2，說明沒有達(dá)到種間遺傳分化水平;而越南大獺蛤群體與施氏獺蛤3個群體的遺傳距離達(dá)到了種間的分化范圍，說明大獺蛤與施氏獺蛤這兩個種之間因棲息地氣候和海水理化因子差異較大，經(jīng)過長期的自然選擇，有較大的遺傳差異，維持了各自種的特點(diǎn)，符合地理距離產(chǎn)生遺傳分化的理論。

聚類分析結(jié)果可以明顯地表現(xiàn)群體間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。在群體間分化較小的前提下，不同的聚類方法可能會出現(xiàn)不同的聚類結(jié)果［9］。本研究結(jié)果表明，采用形態(tài)差異中的主成分分析、聚類分析和RAPD的聚類分析法都一致地把施氏獺蛤各群體和大獺蛤進(jìn)行了準(zhǔn)確區(qū)分，而采用判別式分析法也得出越南大獺蛤群體較施氏獺蛤群體判別率高的結(jié)果，表明越南大獺蛤群體與施氏獺蛤3個群體之間的區(qū)別。本研究結(jié)果表明，施氏獺蛤3個群體各有自己的RAPD特征帶譜，通過8個標(biāo)記可以區(qū)分施氏獺蛤3個群體和大獺蛤群體，并作為施氏獺蛤群體種質(zhì)鑒定的重要依據(jù)，同時香農(nóng)指數(shù)等數(shù)據(jù)也表明了施氏獺蛤3個自然群體的遺傳多樣性較為豐富。

采用形態(tài)差異和RAPD技術(shù)對施氏獺蛤3個群體的遺傳多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各群體維持了較高的遺傳多樣性。影響遺傳分化的主要原因可能是環(huán)境因素，但也要注意在地理范圍較小的孤立環(huán)境中造成群體間遺傳多樣性降低的可能性。筆者認(rèn)為，在對施氏獺蛤進(jìn)行分類、種質(zhì)鑒別、遺傳多樣性分析時，僅依靠形態(tài)分析是不夠的，今后有必要結(jié)合其他分子標(biāo)記 (如SSR等)進(jìn)行更可靠的分析。目前，尚未對施氏獺蛤進(jìn)行大規(guī)模的人工育苗和養(yǎng)殖。施氏獺蛤3個自然群體之間的遺傳距離較大，遺傳多樣性維持在相對高的水平，說明施氏獺蛤仍然保持較為豐富的遺傳資源，因此具有良好的育種前景。

致謝:廣東海洋大學(xué)蔡英亞教授在樣品鑒定方面給予了大力協(xié)助，在此謹(jǐn)致謝忱!

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