王惠榕,高嵐美,蕭劍雄,嚴(yán)延生,張春陽

肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae,Mp)是一種常見的呼吸道病原體,是社區(qū)獲得性肺炎的主要病原體之一,臨床上不易與其他非典型肺炎相區(qū)別。因此對Mp感染的診斷目前主要還是依靠實(shí)驗(yàn)室診斷進(jìn)行鑒別。Mp感染的實(shí)驗(yàn)室診斷方法包括分離培養(yǎng)、血清學(xué)檢測和PCR技術(shù)等。Mp的分離培養(yǎng)可客觀反映Mp的存在,但由于Mp對培養(yǎng)條件要求苛刻,且做出判定需6～15 d,因此分離培養(yǎng)一般不用于Mp感染的臨床診斷。血清學(xué)和分子生物學(xué)試驗(yàn)是Mp感染實(shí)驗(yàn)室診斷常用的方法。分子診斷方面的各式PCR、基因探針等敏感性和特異性雖高,但實(shí)驗(yàn)室條件要求非常嚴(yán)格,設(shè)備要求高不易推廣,且極微量的污染都會造成非特異性擴(kuò)增[1-4]。因此血清學(xué)檢測仍然是目前最重要的診斷方法之一。

血清學(xué)檢測較為常用的方法是明膠顆粒凝集法(PA)和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) (ELISA)。PA檢測IgM、IgG和IgA總抗體。ELISA法操作簡便、快速且可以將IgM與IgG抗體分開檢測,可進(jìn)一步提高診斷的正確率,適合于臨床實(shí)驗(yàn)室作為Mp感染的常規(guī)檢查。Mp感染臨床癥狀出現(xiàn)后7～10 d,血清中可檢出IgM,1個(gè)月達(dá)高峰,維持的時(shí)間較長,在感染第二個(gè)月才開始下降。IgG抗體較IgM上升較晚,感染后2周IgG抗體達(dá)到可檢出的水平,此后持續(xù)升高到癥狀出現(xiàn)后的第5周達(dá)到高峰,特異性的IgG抗體可維持1.5～2年[5],因此IgM 抗體的測定對急性期感染有特異的診斷價(jià)值。隨著國家對醫(yī)學(xué)診斷試劑銷售的日益規(guī)范化,目前國內(nèi)MP的檢測主要采用進(jìn)口試劑,以日本Serodia Myco II試劑盒(PA)使用最為廣泛。這些試劑價(jià)格昂貴,使得一些不發(fā)達(dá)地區(qū)、基層單位無法開展Mp項(xiàng)目檢測,勢必會縮小Mp在呼吸道感染病原分析中所占的比率,還可能導(dǎo)致對呼吸道感染者濫用抗生素,是Mp耐藥菌不斷增加的原因之一。研發(fā)價(jià)廉且優(yōu)質(zhì)的國產(chǎn)試劑盒是當(dāng)務(wù)之急。采用基因工程技術(shù)表達(dá)Mp重組蛋白是一種有效的途徑可以方便地獲得大量廉價(jià)的重組抗原,純化后即可用于免疫學(xué)診斷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清 疑似Mp感染血清標(biāo)本由福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院以及福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院提供。健康成人獻(xiàn)血者血清標(biāo)本由寧德市中心血站提供。麻疹病毒、風(fēng)疹病毒和出血熱病毒感染陽性血清由福建省疾病預(yù)防控制中心保存。

1.1.2 試劑與儀器 大腸桿菌pET32a-2174-3176重組株為本室構(gòu)建;菌株Mp FH株為本室保存菌株;羊抗人IgG-AP和IgM-H RP均為Southernbiotech公司產(chǎn)品,IgG/RF吸收劑為北京歐蒙醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)有限公司產(chǎn)品。樣品稀釋液、酶稀釋液以及顯色液由廈門英科新創(chuàng)公司提供。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá) 接種含重組質(zhì)粒pET32a-2174-3176的 BL21(DE3)單菌落于5mL LB(含氨芐青霉素 100 μ g/mL)液體培養(yǎng)基中,37℃250r/min振蕩培養(yǎng)過夜,次日以1∶100的比例轉(zhuǎn)種50mL LB液體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素 100 μ g/mL)中,37℃250r/min振蕩培養(yǎng)至 A600=0.6左右,加入IPTG至終濃度為1.0mmol/L,繼續(xù)培養(yǎng)3～4h,于4℃8000r/min離心10min收集菌體。10%SDS-PAGE檢測表達(dá)產(chǎn)物,凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后觀察蛋白表達(dá)情況。

1.2.2 Western blot鑒定重組蛋白的抗原活性常規(guī)方法將SDS-PAGE凝膠上的蛋白帶轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜,轉(zhuǎn)印膜加入適量封閉液室溫溫育2h,用肺炎支原體感染者的陽性血清與轉(zhuǎn)印膜雜交,洗膜后加入1∶3 000羊抗人IgG-AP,室溫溫育1 h,洗膜后用BCIP/NBT系統(tǒng)顯色。室溫顯色至蛋白帶清晰后用蒸餾水終止反應(yīng)。

1.2.3 重組蛋白的純化 將收集的菌體用30mLBufferⅠ(5 mmol/L EDTA,20 mmol/L T ris.Cl,150 mmol/L NaCl,調(diào)pH 值至7.2)懸起,置冰浴上,80%強(qiáng)度的超聲進(jìn)行碎菌(相關(guān)參數(shù)為:功率350 W,總時(shí)間20 min,2 s超聲,5 s間隔)。4℃12 000 r/min離心10min,棄上清。沉淀用10 mL的BufferⅠ重新懸起,加10 mL 4%Triton懸浮,4℃過夜后37℃作用30 min,4℃12 000r/min離心10min,棄上清。沉淀依次用2 mmol/L、4 mmol/L、8 mmol/L尿素洗滌,取8 mmol/L尿素洗滌上清進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳 ,CuCl2染色確定目標(biāo)蛋白位置,將含目標(biāo)蛋白的凝膠切出,置于裝有1×Tris-甘氨酸緩沖液的透析袋進(jìn)行電洗脫,2 h/次,共2次。洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE分析,鑒定其純度并測定蛋白濃度。

1.2.4 間接ELISA檢測患者血清中Mp IgM抗體①采用棋盤滴定法確定抗原的包被濃度及抗體的稀釋度。即將重組抗原分別用包被緩沖液進(jìn)行1∶10、1∶20、1 ∶40、1∶80、1∶320、1∶640 稀釋 ;取經(jīng)吸收的強(qiáng)陽性血清1份(PA試驗(yàn)血清效價(jià)達(dá)1∶640)及正常血清 1份用樣本稀釋液分別進(jìn)行1∶10、1∶20、1∶40、1∶100、1∶200稀釋,選擇強(qiáng)陽性參考血清OD與陰性參考血清OD值的比值較大,而包被抗原稀釋度較低的稀釋度作為最適工作濃度。②以每孔100μL確定的抗原最佳工作濃度包被96孔酶標(biāo)板,37℃放置2h,4℃過夜。③用PBST(PBS中含0.05%吐溫-20)洗滌包被的酶標(biāo)板3次。每孔加入封閉液(2%明膠,0.5%酪蛋白溶于PBS)200μL,37℃作用2h。④待檢血清用 IgG/RF吸收劑以1∶10進(jìn)行吸收,室溫(18℃～25℃)溫育30 min。再用樣品稀釋液稀釋,100μL/孔加到酶標(biāo)板中,并設(shè)陽性、陰性及空白對照孔,37℃作用30 min。⑤PBST洗滌3次。⑥用酶稀釋液將羊抗人IgM-HRP按1∶5 000稀釋,100μL/孔加到酶標(biāo)板中,37℃孵育30min。⑦PBST洗滌3次。⑧每孔加顯色劑A 液與B液各50μL,RT 10 min,用2mol/L H2SO450μL終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上以波長450 nm讀取OD值。

到了高三，學(xué)生的主要精力會很自覺地集中在學(xué)習(xí)上，很多同學(xué)不愿意當(dāng)班干部，此時(shí)，為了保持班內(nèi)工作的連續(xù)性和穩(wěn)定性，我一般會沿用原來的班干部隊(duì)伍，但同時(shí)設(shè)立多個(gè)副職，分工到位，變成班內(nèi)人人有事做，人人做小事。這樣一來，既讓更多的人體會了當(dāng)班干部的不易，也鍛煉了部分同學(xué)，爭取他們支持班級建設(shè)，同時(shí)又減輕了我這個(gè)班主任的負(fù)擔(dān)。

1.2.5 Mp IgM陰性血清的判定 使用日本富士肺炎支原體抗體檢測試劑盒SERODIA@-MYCOⅡ(PA法)對120份健康獻(xiàn)血者血清進(jìn)行檢測。滴度＜1∶40的樣本再用EUROIMMUN抗肺炎支原體抗體IgM檢測試劑盒檢測,再次檢測為陰性的樣本可認(rèn)為Mp IgM陰性。

1.2.6 間接ELISA法臨界值的確定 將上述肺炎支原體IgM抗體陰性的血清在最適反應(yīng)條件下,按間接ELISA程序進(jìn)行IgM抗體測定,結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)算血清的平均值(,標(biāo)準(zhǔn)差 s,臨界值的計(jì)算公式為(±3s)。

1.2.7 交叉試驗(yàn) 以重組抗原包被酶標(biāo)板,運(yùn)用建立的ELISA方法檢測麻疹病毒、風(fēng)疹病毒和出血熱病毒陽性血清,按間接 ELISA程序進(jìn)行測定OD值,觀察間接ELISA的特異性。

1.2.8 與商品化的檢測試劑盒對比實(shí)驗(yàn) 用本實(shí)驗(yàn)建立的間接ELISA方法、EUROIMMUN ELISA(IgM)檢測試劑盒以及SERODIA@-MYCOⅡ檢測試劑盒在相同條件下對232份疑似Mp感染者血清樣品進(jìn)行檢測。

2 結(jié) 果

2.1 重組蛋白表達(dá)和活性檢測 重組質(zhì)粒pET32a-2174-3176以 E.coli BL21(DE3)為宿主菌,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,將菌體蛋白進(jìn)行SDS-PAGE,與未經(jīng)誘導(dǎo)pET32a-2174-3176/BL21(DE3)的對照菌比較,可以清楚地看到誘導(dǎo)菌在44.3～66.4 kDa之間有一條明顯的表達(dá)帶出現(xiàn),與預(yù)期56.8 kDa大小的分子量相符,重組蛋白在誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后1h及4h,表達(dá)量在不斷提高,見圖1。重組蛋白的免疫印跡顯示,特異的蛋白帶能與肺炎支原體感染者血清反應(yīng),而不含載體的細(xì)菌、只含空載體的細(xì)菌的相應(yīng)位置均未出現(xiàn)此帶,說明表達(dá)的該重組抗原具有免疫反應(yīng)性(圖2)。

2.2 重組蛋白的純化 重組蛋白經(jīng)電洗脫法純化后,SDS-PAGE電泳呈單一條帶,表明純度高。結(jié)果如圖3。純化后測定蛋白含量,第一次洗滌重組蛋白濃度為0.86mg/mL、第二次洗滌重組蛋白濃度為0.44mg/mL。

圖1 SDS-PAGE分析表達(dá)蛋白Fig.1 SDS-PAGE analysis of expression of pET32a-2174-3176 in E.coli BL21(DE3)

2.3 最佳濃度的確定 經(jīng)棋盤滴定結(jié)果顯示重組蛋白的最適包被濃度為21.5μ g/mL,最佳血清稀釋濃度為1∶100。結(jié)果見表1。

2.4 肺炎支原體陰性樣本的確定 使用PA方法對120份健康獻(xiàn)血者血清進(jìn)行檢測,有98份PA滴度＜1∶40,這98份樣本再用 EUROIMMUN抗肺炎支原體抗體IgM檢測試劑盒檢測,有82份樣本為IgM抗體陰性樣本,即可認(rèn)為82份樣本為肺炎支原體陰性。

2.5 臨界值確定 將上述肺炎支原體抗體陰性的血清在最適反應(yīng)條件下,按優(yōu)化的間接ELISA程序進(jìn)行IgM抗體測定,計(jì)算82份血清的平均OD值,結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。82份 IgM抗體血清OD450值測定結(jié)果,OD450平均值為0.136,標(biāo)準(zhǔn)差為0.059。即OD450≥0.185為陽性,OD450＜0.185判定為陰性。確定判定標(biāo)準(zhǔn)為:P/N≥2.1,OD450≥0.185為陽性。見表2。

2.6 交叉反應(yīng)試驗(yàn) 檢測風(fēng)疹病毒、麻疹病毒以及出血熱病毒陽性血清各5份,均無交叉反應(yīng)。

2.7 與商品化的檢測試劑盒對比實(shí)驗(yàn) 用重組蛋白間接ELISA法和EUROIMMUN抗肺炎支原體抗體IgM檢測試劑盒在相同條件下對232份樣品進(jìn)行檢測。EUROIMMUN試劑盒在結(jié)果判定時(shí)有8份樣本判定為可疑,需于7 d以后再次采集樣本。因無法進(jìn)行第二次血樣的采集,這8份樣品不納入統(tǒng)計(jì)分析。經(jīng)統(tǒng)計(jì)兩種方法的符合率為89.29%,χ2=1.043(P＞0.05),利用重組蛋白和EUROIMMUN檢出率的差異性無統(tǒng)計(jì)意義,以EUROIMMUN為參照標(biāo)準(zhǔn),重組蛋白的敏感性為94.27%,特異性為77.61%,結(jié)果見表3。PA檢測的結(jié)果有93份樣本滴度≥1∶320,25份滴度＜1∶40。將這118份樣本的EUROIMMUN和重組抗原ELISA方法的檢測結(jié)果分別同PA法結(jié)果進(jìn)行比較。以PA結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn),經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析,EUROIMMUN與PA方法的符合率為86.44%,EUROIMMUN方法的敏感性為 89.25%,特異性為76%,結(jié)果見表4。重組蛋白與PA方法的符合率為94.07%,重組蛋白的敏感性為96.78%,特異性為 84%,結(jié)果見表5。

表1 抗原最適包被濃度及血清最佳稀釋度的確定Table 1 Determination of the optimal antigen dilutions and serumdilutions

表2 臨界值的確定Table 2 Determination for the cutoff

表3 EUROIMMUN和重組蛋白ELISA檢測疑似Mp感染者血清結(jié)果的比較Table 3 Comparison of detecting serum from suspected Mp infections by EUROIMMUNand recombinant proteins ELISA

表4 EUROIMMUN ELISA和PA檢測疑似Mp感染者血清結(jié)果的比較Table 4 Comparison of detecting serum from suspected Mp infections by EUROIMMUN ELISA and PA method

表5 PA和和重組蛋白ELISA檢測疑似Mp感染者血清結(jié)果的比較Table 5 Comparison of detecting serum from suspected Mp infections by PA method and recombinant proteins ELISA

3 討 論

從蛋白表達(dá)產(chǎn)物的形式來看,我們構(gòu)建的原核重組表達(dá)質(zhì)粒所表達(dá)的蛋白是以包涵體形式存在,經(jīng)免疫印跡確認(rèn),該重組蛋白具有強(qiáng)烈的反應(yīng)原性,說明表達(dá)產(chǎn)物有作為診斷抗原的潛力。

應(yīng)用表達(dá)蛋白建立間接ELISA方法時(shí),在待檢血清被稀釋之前,先使用IgG/RF吸附劑進(jìn)行免疫吸附反應(yīng)。因?yàn)殚g接ELISA法檢測IgM抗體的關(guān)鍵是必須去除患者血清中的IgG抗體,以防止IgM型類風(fēng)濕因子與特異性IgG抗體反應(yīng)而產(chǎn)生IgM抗體的假陽性,也可避免檢測患者血清中的IgM抗體之前特異性IgG抗體替代IgM抗體與抗原結(jié)合,從而產(chǎn)生IgM抗體的假陰性結(jié)果。

評估一個(gè)新建立實(shí)驗(yàn)方法的敏感性,需要確診為Mp感染的陽性血清,即需要一個(gè)金標(biāo)準(zhǔn)來判定標(biāo)本是否為真陽性,但Mp感染卻缺乏判定金標(biāo)準(zhǔn)。因此怎樣確定真陽性一直是個(gè)懸而未決的問題。有人建議用培養(yǎng)或PCR的方法作為病原體存在的證據(jù),但本研究均未采用。一方面是因?yàn)槲覀兊臉颖揪鶠榕R床常規(guī)檢測后的留樣,培養(yǎng)或PCR法都不是臨床常規(guī)的檢測方法,因此沒法獲得用來培養(yǎng)或做PCR用的臨床標(biāo)本。其次,就培養(yǎng)和PCR兩種方法學(xué)而言,分離培養(yǎng)耗時(shí)且培養(yǎng)陽性率不高;PCR檢測的是病原體,而不是機(jī)體的免疫應(yīng)答。因此我們選擇將建立的間接ELISA法同我省較常使用的兩種進(jìn)口商品化試劑盒進(jìn)行比對,即以其中一種商品化試劑盒作為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)來評估我們建立的間接ELISA方法的敏感性和特異性。目前在我國血清學(xué)檢測Mp感染僅有SERODIA@-MYCOⅡ檢測試劑盒(PA法)獲得注冊證,因而,可以認(rèn)為PA法的結(jié)果是較為可靠的。PA法測定Mp抗體是以明膠顆粒為載體,用Mp細(xì)胞膜成分來致敏的,因而具有較高的敏感性。用ELISA測定IgA、ELISA測定IgG結(jié)果和PA滴度存在差異,表明被動(dòng)凝集法主要反映的是IgM經(jīng)典抗體[6]。但PA試劑盒cutoff值的確定卻存在爭議,因?yàn)榈退降目贵w滴度可能是既往感染產(chǎn)生的抗體,也可能是新近感染產(chǎn)生的抗體。研究表明以PA滴度≥1∶160為cutoff值,仍存在非特異反應(yīng),而要較準(zhǔn)確判定 Mp感染,以PA滴度≥1∶320作為cutoff值為佳[7],因此我們將PA滴度≥1∶320,視為Mp IgM抗體陽性。但在Mp陰性血清界定的過程中,我們還是采用試劑盒推薦的1∶40作為cutoff值,將PA檢測結(jié)果為陰性的樣本用EUROIMMUN試劑盒再次篩檢,再次篩檢結(jié)果為陰性的樣本我們判為該血清Mp IgM抗體陰性,這種聯(lián)合檢測有利于提高陰性血清判定的特異性。

本研究建立的間接ELISA法結(jié)果顯示,如以EUROIMMUN ELISA試劑盒診斷結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn),本方法的敏感性為94.27%,特異性僅為77.61%。如以PA法診斷結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn),本方法的敏感性為94.07%,特異性可達(dá)84%,而EUROIMMUN方法的敏感性為89.25%,特異性為76%,且重組蛋白間接ELISA法與PA法的符合率要高于EUROIMMUN法。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本研究建立的診斷方法具有良好的特異性和敏感性,為進(jìn)一步開發(fā)商品化試劑盒奠定了基礎(chǔ)。但此次臨床血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果只是初步的,檢測血清份數(shù)較少,尤其是缺乏Mp感染急性期和恢復(fù)期雙份血清的驗(yàn)證,要成為商品化試劑還有許多工作要做。

[1]Ieven M,Goossens H.Relevance of nucleic acid amplification techniques for diagnosis of respiratory tract infections in the clinical laboratory[J].Clin Microbiol Rev,1997,10(2):242-256.

[2]Abele-Horn M,Busch U,Nitschko H,et al.Molecular approaches to diag nosis of pulmonary disease due to Mycoplasma pneumoniae[J].J Clin Microbiol,1998,36(2):548-551.

[3]Hardegger D,Nadal D,Bossart W,et al.Rapid detection of Mycoplasma pneumoniae in clinical samples by real-time PCR[J].J Microbiol Methods,2000,41(1):45-51.

[4]Ton CYW,Donnelly C,Harvey G,et al.Multiplex polymerase chain reaction for the simultaneous detection of Mycoplasma pneumoniae,Chlamydia pneumoniae,and Chlamydia psittaci in respiratory samples[J].J Clin Pathol,1999,52(4):257-263.

[5]曹玉璞,葉元康.支原體與支原體病[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2000:46.

[6]TsutomuYamazaki,Mitsuo Narita,Nozomu Sasaki,et al.Comparison Of PCR for sputum samples obtained by induced cough and sero logicaltests for diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection in children[J].Clin Vaccine Immunol,2006,13(6):708-710.

[7]T empleton KE,Scheltinga SA,Graffelman AW,et al.Comparison and evaluation of real-time PCR,real-time nucleic acid sequence-based amplification,conventional PCR,and Serology for Diagnosis of Mycoplasma pneumoniae[J].J Clin Microbiol,2003,41(9):4366-4371.