夏廣清，韓曉娟

(1.通化師范學院 生物系，吉林 通化 134002；2.東北師范大學，吉林 長春 130000)

黃芪抗衰老作用的研究以體內實驗和血清藥理學方法為常見[1-2].黃芪多糖(astragalin polyose APS)為黃芪的主要成分，大量藥理及臨床實驗結果表明，APS具有抗衰老活性[3].本實驗以斑馬魚為實驗材料，觀察了黃芪多糖不同濃度對其細胞分化及與細胞信號轉導通路關鍵基因表達的影響，為黃芪多糖抗衰老提供理論依據.

1 材料與方法

材料：野生型斑馬魚由中國海洋大學生命科學院提供，在處理的前一天，將雌雄斑馬魚雌雄進行分離，并與第二天上午進行交配后收集魚卵，并在28℃條件下培養(yǎng)，取孵育8小時發(fā)育正常的斑馬魚幼胚置于24微孔板中，每一微孔板15只斑馬魚幼胚，設置三次重復，每一處理分別設置空白對照組、黃芪多糖低(0.125mg/ml)、中(0.25mg/ml)、高(0.5mg/ml)濃度進行處理，每一天更換一次培養(yǎng)液，連續(xù)處理三天，搜集樣品，進行染色及基因表達分析.

藥物及試劑:黃芪多糖純樣品購自陜西昂盛生物醫(yī)藥科技有限公司，β-半乳糖苷酶及吖啶購自Sigma公司.將10mg黃芪多糖溶于1ml孵育魚卵用的水溶液中(egg water)，制成10mg/ml儲存液，4℃保存.

樣品的采集與處理:取孵育8個小時發(fā)育正常的斑馬魚進行藥物處理，每一處理濃度30個樣品，三次重復，連續(xù)處理三天，光學顯微鏡下觀察魚的生長發(fā)育狀態(tài).

樣品的SA-β-gal染色分析:取連續(xù)處理三天發(fā)育正常的斑馬魚樣品，PBS洗3～5次，4%paraformal-dehyde(PFA)4℃固定1～3天；PBS洗3～4次后PBS保存1～3天；然后PBS洗1次，加入染色液(25ul/ml)37℃培養(yǎng)16～24小時觀察照相.

樣品AO染色分析：取處理3天的樣品，放置在含200ug/ml的AO的溶液中.30℃條件下培養(yǎng)30分鐘，然后用孵育魚卵水溶液洗8次，每次5分鐘后，進行觀察照相.

2 實驗結果與分析

2.1黃芪多糖對斑馬魚生長發(fā)育的影響

給藥處理24h后，統(tǒng)計了各處理對斑馬魚存活的影響，結果見圖1.分析結果表明，黃芪多糖在0.125～0.25mg/ml對斑馬魚的發(fā)育影響不大，但當黃芪多糖濃度高于0.5mg/ml時，斑馬魚的生存受到影響，與對照相比達到0.01顯著水平.此外，高濃度的黃芪多糖除引起斑馬魚高的致死率外，對斑馬魚的發(fā)育也產生了明顯的影響，在高黃芪多糖處理濃度下，斑馬魚表現(xiàn)為生長彎曲的畸形生長狀態(tài)(見圖2)，這也許是導致斑馬魚致死的主要原因.

圖1 黃芪多糖不同濃度對斑馬魚存活的影響。 圖2 (a)發(fā)育正常的斑馬魚，(b)生長畸形的斑馬魚

2.2黃芪多糖處理對斑馬魚衰老的影響

以往對黃芪抗衰老的作用實驗表明，黃芪提取物能通過增加內生性的抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性，穩(wěn)定細胞膜，從而減輕神經細胞損害，延緩細胞衰老.SA-β-Gal陽性率能較好地反應細胞群體或個體組織的老化速度，是反映衰老程度的重要生物學指標，被廣泛應用.黃芪多糖不同濃度處理斑馬魚的SA-β-Gal染色結果表明(圖3)，低濃度的黃芪多糖(0.125～0.25mg/ml)能有效干預斑馬魚胚胎發(fā)育細胞的衰老.然而在胚胎發(fā)育的早期的AO染色結果表明，各處理濃度對細胞早期的凋亡并沒有顯著影響(圖4).

圖3黃芪多糖處理對斑馬魚SA-β-Gal染色的影響(A SA-β-gal熒光統(tǒng)計分析圖；B SA-β-gal熒光染色圖a對照，b、c、d分別代表黃芪多糖濃度0.125mg/ml, 0.25mg/ml和0.5mg/ml)

圖4黃芪多糖處理對斑馬魚AO染色的影響(A AAO染色熒光統(tǒng)計分析圖；B AO熒光染色圖a對照，b、 、c d分別代表黃芪多糖濃度0.125mg/ml, 0.25mg/ml和0.5mg/ml)

3 討論

近年來延緩衰老以及老年病的預防已經成為國內外研究的焦點，尋找有效地抗衰老藥物是衰老研究中的一個重要方面，由于化學藥物的廣泛使用及其毒副作用，研究的方向已矚目與傳統(tǒng)中藥.黃芪是最常用的“扶正固本，補中益氣”中藥之一，研究表明黃芪提取物及其有效成分可以減少自由基的過氧化作用，增強抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性，穩(wěn)定細胞膜，延緩細胞衰老.但以往的研究多集中在細胞水平上，在斑馬魚的研究上尚未見相關報道.斑馬魚繁殖能力強，適于大規(guī)模誘變育種，其體外受精和胚胎透明的特點使其便于觀察，此外，斑馬魚從受精卵開始到120小時，細胞增殖、遷移、分化，最終形成各種器官、組織，并且開始行使相應的生理生化功能.這一階段，是斑馬魚基因作用的最活躍階段，也是斑馬魚胚胎發(fā)育過程中最重要階段，因此，斑馬魚作為新型模式動物的優(yōu)勢正在逐漸被人們所認識，它在遺傳學，發(fā)育生物學的研究中已被越來越廣泛的應用[4].斑馬魚的神經中樞系統(tǒng)、內臟器官、血液以及視覺系統(tǒng)，在基因水平上87%與人類同源，早期發(fā)育與人類極為相似，已成為研究相關疾病基因的最佳模式生物.在國際上，斑馬魚模式生物的使用正逐漸拓展和深入生命體的多種系統(tǒng)(例如，神經系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等)的發(fā)育、功能和疾病(例如，神經退行性疾病、遺傳性心血管疾病、糖尿病等)的研究中，并已用于小分子化合物的規(guī)模新藥篩選.

本實驗結果表明，黃芪多糖可以增強細胞活力，β-半乳糖苷酶活性下降，提示黃芪多糖在體內有很好的抗衰老作用.

參考文獻：

[1]張鵬霞，樸金花，歐芹，等.黃芪對老年小鼠線粒體Mn-SOD，MDA及腦細胞凋亡影響的實驗研究[J].中國老年學雜志，2003，23(9).

[2]李泓梅，等.黃芪血清藥理對人胚肺二倍體成纖細胞(HDF)抗衰老作用機制的研究[J].中國老年學雜志，2005，25(12).

[3]趙蓮芳，鄭玉淑，樸慧順，等.黃芪多糖及人參皂苷對衰老小鼠的抗衰老作用[J].延邊大學醫(yī)學學報，2006，12(29).

[4]鄭麗麗，吳端生.斑馬魚實驗動物化研究及應用[J].南華大學學報(醫(yī)學版)，2008，36(2).