劉 偉，劉 翔，林漫鵬，鄭雪玲，楊 濤

廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科(廣東 廣州 510260)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種慢性非特異性的炎癥性腸病，其病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確。目前多認(rèn)為是由多種因素共同作用的結(jié)果，主要包括感染、免疫、遺傳、精神及心理等因素，其中感染因素在UC發(fā)病中發(fā)揮重要作用，因此近年來對(duì)UC和腸道菌群之間的關(guān)系展開了大量的研究。腸道菌群失調(diào)對(duì)于UC的致病機(jī)制究竟有何意義尚不完全清楚，故本項(xiàng)目選取病變僅局限于乙狀結(jié)腸以下的潰瘍性結(jié)腸炎患者，分別在乙狀結(jié)腸以上的正常腸段和乙狀結(jié)腸以下的病變腸段用結(jié)腸鏡取得活檢標(biāo)本，用PCR方法檢測標(biāo)本的細(xì)菌含量，從而比較正常腸段和異常腸段的菌群差異，以探討腸道菌群失調(diào)在UC致病機(jī)制中的可能作用。

1 資料和方法

1.1患者入選標(biāo)準(zhǔn)潰瘍性結(jié)腸炎患者40例，均為我院就診的患者，均經(jīng)結(jié)腸鏡和病理學(xué)檢查確診，且病變均局限在乙狀結(jié)腸及以下腸段。其中男性患者21例，女性患者19例，年齡16～83歲，平均年齡52歲，分別在病變腸段(乙狀結(jié)腸以下腸道)及正常腸段(乙狀結(jié)腸以上腸道)取粘膜組織做細(xì)菌學(xué)檢查。另選40例正常對(duì)照，其中女性20例，男性20例，年齡18～75歲，平均年齡48歲，分別在乙狀結(jié)腸以上腸段及乙狀結(jié)腸以下腸段取粘膜組織做細(xì)菌學(xué)檢查。

1.2材料和儀器DNA提取試劑購自廣州達(dá)安基因，10×PCR buffer、dNTPs、Taq酶等購自Tiangen公司。常規(guī)的化學(xué)試劑為分析純。生物安全柜Bioaer公司BSC-1500Ⅱ型，熒光PCR儀Biorad公司MJ Opticon2型。

細(xì)菌引物：上游通用引物BEL863f：CAGGATTAGATACCCTGGTAGTCC；下游特異引物：雙歧桿菌引物B953r：CGTTAGCTCCGACACGGAACCC；乳酸桿菌引物L(fēng)961r：GCTTAATGCGTTAGCTGCRGCACTG；大腸桿菌引物E953r：CGTTAGCTCCGGAAGCCACGCC。探針：雙歧桿菌探針B892：FAM-CCGTAAACGGTGGATGCTGGATGTGGGG-BHQ1；乳酸桿菌探針L892：FAM-CCGTAAACGATGARTGCTARGTGTTGGAGGG-BHQ1；大腸桿菌探針E892：FAM-CCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTGC-BHQ1。均由上海英駿生物技術(shù)有限公司ABI 3900臺(tái)式高通量DNA合成儀合成。

1.3試驗(yàn)方法50 mg組織研磨成勻漿，提取DNA后，100℃ 10 min，12000 r/min，5 min，立即使用熒光PCR。25 μl體系，94℃ 2 min；94℃5 sec，55℃30 sec，read plate(FAM)，40 cycles，30℃ 5 sec。反應(yīng)結(jié)束后，MJ Opticon2自動(dòng)分析并計(jì)算結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1健康人腸道菌群對(duì)數(shù)值健康人乙狀結(jié)腸以上腸段雙歧桿菌、乳酸桿菌及大腸桿菌數(shù)量對(duì)數(shù)值分別為8.71±0.44、9.01±0.33、7.01±0.13，乙狀結(jié)腸以下腸段雙歧桿菌、乳酸桿菌及大腸桿菌數(shù)量對(duì)數(shù)值為9.21±0.24、9.02±0.18、7.12±0.21，乙狀結(jié)腸以上腸段與乙狀結(jié)腸以下腸段細(xì)菌數(shù)量無明顯差異(P<0.05)。見表1。

2.2 UC患者腸道菌群對(duì)數(shù)值

2.2.1 UC患者乙狀結(jié)腸以上腸段與乙狀結(jié)腸以下腸段菌群比較：雙歧桿菌、乳酸桿菌含量均明顯降低(P<0.05)，大腸桿菌明顯升高(P<0.05)。見表1。

2.2.2 UC患者與健康人腸道菌群比較：UC患者正常腸段與健康人乙狀結(jié)腸以上及乙狀結(jié)腸以下腸段比較，雙歧桿菌、乳酸桿菌及大腸桿菌數(shù)量均無明顯差別(P>0.05)；UC患者病變腸段與健康人乙狀結(jié)腸以上及乙狀結(jié)腸以下腸段比較，雙歧桿菌、乳酸桿菌含量均明顯降低(P<0.05)，大腸桿菌明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組樣本中細(xì)菌的對(duì)數(shù)值

3 討論

每年都有大量的UC患者被新發(fā)現(xiàn)和確診。因?yàn)閁C的病因及發(fā)病機(jī)制迄今未明，故缺乏有效的預(yù)防及藥物徹底治愈的方法，被稱為“不是癌癥的癌癥”，不僅給患者帶來極大的身心傷害，而且極大的耗費(fèi)著社會(huì)的醫(yī)療資源。弄清UC的發(fā)病機(jī)制并尋找其有效的治療手段就成為了當(dāng)前重要而迫切的任務(wù)。

對(duì)于UC和腸道菌群之間的關(guān)系，目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為是腸道菌群的組成、比例等方面的改變導(dǎo)致腸道內(nèi)微生態(tài)環(huán)境的變化，從而引起宿主產(chǎn)生異常免疫反應(yīng)導(dǎo)致UC的發(fā)病[1～5]。本研究發(fā)現(xiàn)正常人腸道不同部位其雙歧桿菌、乳酸桿菌及大腸桿菌數(shù)量大致是相當(dāng)?shù)模f明正常人結(jié)腸的菌群比較穩(wěn)定而且一致，提示在用益生菌療法時(shí)無須考慮結(jié)腸腸道菌群差異的問題，全結(jié)腸均可以選用相應(yīng)的益生菌制劑。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，UC患者的病變腸腔粘膜上，雙歧桿菌、乳酸桿菌的數(shù)量較正常腸腔明顯降低，說明病變腸腔粘膜微生態(tài)已經(jīng)嚴(yán)重破壞，這與國外Poxton[6]等人的研究是一致的。但雙歧桿菌、乳酸桿菌的數(shù)量變化是造成UC疾病的始動(dòng)因素，還是UC病變破壞腸道粘膜，使得雙歧桿菌、乳酸桿菌繼發(fā)性減少，尚不確定。但本研究亦發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌、乳酸桿菌減少的同時(shí)大腸桿菌卻反而升高，考慮UC病變破壞腸道粘膜單單引起雙歧桿菌、乳酸桿菌減少的可能性不大，故提示雙歧桿菌、乳酸桿菌的數(shù)量變化參與UC疾病的發(fā)病機(jī)制的可能性更大，國外Alexander[7～9]等學(xué)者認(rèn)為正是由于腸道粘膜菌群失調(diào)，并且腸粘膜清除細(xì)菌的功能受損，使得糞便中致病菌的侵襲性顯著增加，促進(jìn)了局部炎癥及免疫紊亂的發(fā)生，最終導(dǎo)致UC，故可在此方面進(jìn)一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)UC患者的病變腸腔粘膜與正常人腸道粘膜的菌群比較亦存在雙歧桿菌、乳酸桿菌數(shù)量降低、大腸桿菌升高的特點(diǎn)，提示在益生菌療法上可先予抗生素殺滅大腸桿菌等致病菌，繼而補(bǔ)充雙歧桿菌、乳酸桿菌的序貫療法，則不但可殺滅致病菌，而且有利于雙歧桿菌、乳酸桿菌等益生菌避開抗生素使用時(shí)期，更易于定植，可進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)研究。

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