吳長生，伍嚴安，胡辛蘭，李 寧

(福建省立醫(yī)院檢驗科，福建福州 350001)

鮑曼不動桿菌是一種條件致病菌，對目前常用的多種抗菌藥物耐藥。整合子是一種與耐藥基因水平傳播有關的新的可移動基因元件，攜帶位點特異性重組系統(tǒng)組分，根據(jù)整合酶基因的DNA堿基序列的不同，整合子可以分為4類：I類、Ⅱ類、Ⅲ類和Ⅳ類整合子。I類、Ⅱ類和Ⅲ類整合子與細菌耐藥關系比較密切，又常被合稱為耐藥整合子(resistance integron，RI)。本研究通過簡并引物PCR法，調(diào)查福建省立醫(yī)院患者的標本中分離的鮑曼不動桿菌攜帶整合子的情況，并分析整合子與細菌耐藥性的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 93株鮑曼不動桿菌為2007年11月至2008年10月，從福建省立醫(yī)院臨床標本中分離，剔除耐藥表型完全一致的菌株。I類整合子陽性標準菌株V517由華南理工大學輕工與食品學院石磊教授惠贈，Ⅱ類整合子陽性對照株由福建CDC惠贈。

1.1.2 儀器 VITEK 2全自動細菌鑒定和藥敏分析儀 (法國bioMerieux公司)，BIOER Tc-25/H 基因擴增儀 (杭州博日科技有限公司)，F(xiàn)X-DY-252型水平電泳儀(上海復星高科技集團有限公司)，凝膠成像系統(tǒng)(UVItec limited)。

1.1.3 試劑 VITEK 2全自動細菌鑒定和藥敏分析儀所用試劑為法國bioMerieux公司產(chǎn)品。藥敏紙片和M-H(Mueller-Hinton)瓊脂為英國Oxoid公司產(chǎn)品。Chelexl00為BIO-RAD公司產(chǎn)品。Taq DNA聚合酶，dNTPs，Taq buffer(Mg2+Plus)，Hinf I 等均為TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細菌鑒定和藥敏試驗 采用VITEK 2全自動細菌鑒定和藥敏鑒定和藥敏分析儀，進行細菌鑒定和抗菌藥物敏感性測定。每批均以銅綠假單胞菌ATCC27853作為質(zhì)控菌株進行質(zhì)量控制，結(jié)果按美國臨床實驗室標準協(xié)會 (Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)標準進行判讀[1]。

1.2.2 細菌總DNA的提取 采用Chelex100法[2]，提取的細菌DNA，用紫外分光光度計測量260nm、280nm OD 值，OD260/OD280為 1.66～1.70。

1.2.3 整合子檢測及分類 參照文獻設計簡并引物[3]，由寶生物工程(大連)有限公司合成。上游引物為 hep35：5′-TGCGGGTYAARGATBTKGATTT-3′，下游引物為 hep36：5′-CARCACATGCGTRTARAT-3′，該引物可同時擴增整合子5’保守區(qū)的Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類整合酶基因，預計擴增片段為491bp。參考有關文獻[4-5]，采用25μl反應體系：上下游引物(l0μmol/L) 各 1.0μl，模板 1.0μl，dNTPs(200μmol/l)2.0μl，Taq buffer(Mg2+Plus)2.5μl，Taq DNA 聚合酶(5U/μl)0.125μl，超純水 17.375μl。參考有關文獻[5，6]和對循環(huán)條件的優(yōu)化結(jié)果，確定以下PCR反應條件：94℃預變性 5min；94℃ 30s，52℃ 40s，72℃ 40s，循環(huán)35次；最后72℃延伸5min。簡并引物擴增的陽性產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶Hinf I進行限制性片段長度多態(tài)性 (RFLP)分析， 酶切反應體系：PCR產(chǎn) 物8.0μl，10 × H Buffer 2.0μl，Hinf I(l0U/μl)1.0μl，超純水9.0μl。37℃水浴4h，酶切產(chǎn)物用含溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳分析 (電壓70V，時間30min)，對整合子進行分類，依據(jù)見表1[3]。

表1 整合子酶切分類依據(jù)

1.2.4 統(tǒng)計學分析 統(tǒng)計分析采用SPSS 13.0軟件，率的比較用卡方檢驗或Fisher確切概率法檢驗。

2 結(jié)果

2.1 整合子檢測及分類結(jié)果 在93株鮑曼不動桿菌中有22株檢出整合子，檢出率為23.6%，整合子檢測電泳圖見圖1。PCR-RFLP結(jié)果顯示均為Ⅰ類整合子，未檢出Ⅱ類和Ⅲ類整合子，整合子酶切分類電泳圖見圖2。

圖1 整合子檢測電泳圖

圖2 整合子擴增陽性產(chǎn)物酶切后電泳圖

2.2 I類整合子與鮑曼不動桿菌耐藥和多重耐藥的關系 對I類整合子陽性和I類整合子陰性的鮑曼不動桿菌的藥敏情況進行分析，結(jié)果顯示：哌拉西林、替卡西林/棒酸、頭孢他啶、頭孢吡肟、亞胺培南、美羅培南、哌拉西林/他唑巴坦、左旋氧氟沙星、慶大霉素、妥布霉素、復方新諾明共11種抗菌藥在整合子陽性組的耐藥率明顯高于整合子陰性組，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，詳見表2。

在I類整合子陽性的22株鮑曼不動桿菌中，多重耐藥菌有21株，占95.4%；而I類整合子陰性的71株鮑曼不動桿菌中，多重耐藥菌只占74.6%。對二組細菌的多重耐藥發(fā)生率進行比較，結(jié)果顯示：I類整合子陽性菌株的多重耐藥發(fā)生率比I類整合子陰性菌株高，兩者有顯著性差異(P＜0.05)，說明整合子與細菌多重耐藥的發(fā)生有關，見表3。

3 討論

表2 鮑曼不動桿菌I類整合子與耐藥表型的關系

表3 二組細菌的多重耐藥發(fā)生率的比較

鮑曼不動桿菌 (Acinetobacter baumanii，ABA)是引起醫(yī)院感染的常見條件致病菌，在臨床分離的非發(fā)酵菌中僅次于銅綠假單胞菌。ABA常可引起患有嚴重基礎性疾病和重癥監(jiān)護室內(nèi)使用呼吸機等侵入性裝置的患者的感染。

本研究中，ABA的耐藥現(xiàn)象十分普遍，多重耐藥菌株占細菌總數(shù)的77.4%，對青霉素類、頭孢菌素類、慶大霉素均具有很高的耐藥率(＞70%)，耐藥率較低的有頭孢哌酮/舒巴坦和阿米卡星，與國內(nèi)相關報道相似[7，8]。

本研究應用的簡并引物PCR法，可同時擴增整合子5′保守區(qū)的I類、Ⅱ類和Ⅲ類整合酶基因，再通過PCR-RFLP分析確定整合子的類別，可節(jié)省實驗時間，降低成本，是一種對大量臨床菌株進行整合子篩選的理想方法。

本研究結(jié)果顯示，ABA中整合子的檢出率為23.6%，酶切結(jié)果顯示均為Ⅰ類整合子，明顯低于國內(nèi)的相關報道[9]，而高于國外的相關報道[10]，推測主要是與標本的選擇和地域差異有關,本研究在收集標本時剔除了耐藥表型完全相同的菌株，避免了同一來源菌株的重復收集；國內(nèi)的相關報道陽性率高達90%，可能與陽性菌株的暴發(fā)流行有關；而國外相關研究的標本來自于不同國家不同醫(yī)院。

細菌耐藥性通常由獲得耐藥基因引起，在抗菌藥物選擇性壓力下，耐藥基因的水平傳播是一個日益嚴重的問題，耐藥基因的水平傳播使耐藥菌株廣泛流行[11]。

整合子具有通過位點特異重組機制整合多個耐藥基因盒的能力，介導多藥耐藥的形成。本研究中，許多抗菌藥在I類整合子陽性組的耐藥率明顯高于陰性組，并且具有統(tǒng)計學意義；統(tǒng)計結(jié)果顯示，整合子與細菌多重耐藥的發(fā)生有關。

對整合子介導和傳播耐藥性的研究，有助于理解革蘭陰性菌耐藥性和多重耐藥性的分子基礎，為合理使用抗菌藥物和控制細菌耐藥性發(fā)展提供理論基礎。

[1]Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI).Performance standards for antimicrobial susceptibility testing;Seventeenth information supplement[S].M100-S17,2007,27(1):32-33.

[2]夏 涵,府偉靈,陳 鳴,等.快速提取細菌DNA方法的研究[J].現(xiàn)代預防醫(yī)學,2005,32(5):571-573.

[3]White PA,McIver CJ,Rawlinson WD.Integrons and gene cassettes in the entero-bacteriaceae[J].Antimicrob Agents Chemother,2001,45(9):2658-2661.

[4]Levesque C,Piche L,Larose C,et al.PCR mapping of integrons reveals several novel combinations of resistance genes[J].Antimicrob Agents Chemother,1995,39(1):185-191.

[5]Daly M,Buckley J,Power E,et al.Molecular characterization of Irish Salmonella enterica serotype typhimurium:detection of class I integrons and assessment of gene-tic relationships by DNA amplification fingerprinting[J].Appl Environ Microbiol,2000,66(2):614-619.

[6]Didier M,Broderick D,Vera A,et al.Antibiotic Resistance in the ECOR Collection:Integrons and Identification of a Novel aad Gene[J].Antimicrob Agents Chemother,2000,44(6):1568-1574.

[7]王紅華.下呼吸道鮑曼不動桿菌分離株的耐藥性分析[J].實驗與檢驗醫(yī)學,2008,26(2):147-148.

[8]蘇 榮,張勁豐,楊延斌.340株鮑曼不動桿菌的臨床分離與耐藥性分析[J].實驗與檢驗醫(yī)學,2010,28(4):391.

[9]杜 艷,陳 端,單 斌,等.整合子相關的銅綠假單胞菌耐藥性分析[J].檢驗醫(yī)學,2005,20(6):556-558.

[10]Martinez-Freijo P,Fluit AC,Schmitz FJ,et al.Class I integrons in Gram-negative isolates from different European hospitals and association with decreased susceptibility to multiple antibiotic compounds[J].J Antimicrob Chemother,1998,42(6):689-696.

[11]Severino P,Magalhaes VD.The role of integrons in the dissemination of anti-biotic resistance among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa from an intensive care unit in Brazil[J].Res Microbiol,2002,153(4):221-226.