曹莉萍，葉 倩 ，陳光明 ，譚立明 ，劉 川 ，李 軍

(1、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西南昌330006；2、高安市瑞州醫(yī)院，江西高安 330800)

慢性乙肝肝炎是我國(guó)乃至世界突出的公共衛(wèi)生問題。抗病毒治療一直被視為慢乙肝患者的主要治療方法。核苷類似物--拉米夫定早期被認(rèn)為是抗乙肝病毒首選藥物，但隨著對(duì)其認(rèn)識(shí)深入及回顧研究發(fā)現(xiàn)，其致病毒基因突變很高。2005年，一種新的核苷類似物-阿德福韋(adefovir diivoxil,ADV)獲得美國(guó)等多國(guó)FDA批準(zhǔn)用于慢性乙肝的治療。隨著

ADV廣泛的應(yīng)用，耐藥患者不斷的增加，對(duì)其耐藥基因的檢測(cè)已顯得尤為重要。目前得到學(xué)術(shù)界公認(rèn)的耐藥株有兩種：rtN236T變異和rtA181V變異。本課題組采用國(guó)際上先進(jìn)的巢式聚合酶鏈反應(yīng)—限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)技術(shù)(ntPCR-RFLP)技術(shù)對(duì)治療的不同階段患者進(jìn)行該兩種耐藥株進(jìn)行檢測(cè)，旨在了解接受阿德福韋治療后HBV的基因變異情況。

1 材料與方法

1.1 病例來源

來自南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院住院及門診2007年1月至2009年1月收治的100例慢性乙肝患者，其中5例未能堅(jiān)持隨訪。所有入選病例均單用阿德福韋酯治療(10mg、每日一次，療程大于6個(gè)月)，男性 67例，女性33例，年齡19～68歲。慢乙肝診斷符合2000年全國(guó)病毒性肝炎與肝病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。HBeAg均陽性，血清HBV-DNA水平≥103拷貝/ml，伴有 ALT升高2～10倍；腎功能正常；超聲CT檢查均無明顯的肝內(nèi)占位證據(jù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他肝炎病毒、巨細(xì)胞病毒、EB病毒等重疊感染；②失代償期肝硬化，肝癌，乙醇性或自身免疫性肝病，妊娠或哺乳期婦女等；③半年內(nèi)應(yīng)用過于擾素、免疫調(diào)節(jié)劑或其他核苷類抗HBV藥物。

1.2 主要試劑與儀器

低溫高速離心機(jī) (美國(guó)Beckman公司)；DNA回收試劑盒 (美國(guó)OMEGA公司)；核酸提取試劑盒及HBV-DNA熒光定量試劑盒 (深圳匹基生物技術(shù)有限公司)；低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)；DNA回收試劑盒 (美國(guó)OMEGA公司)；MyCycler型基因PCR擴(kuò)增儀及Geldoc XR型凝膠成像及圖像分析系統(tǒng)(美國(guó)BIOCAD公司)。

1.3 方法

1.3.1 DNA提?。翰捎卯惲蚯杷犭乙徊椒ㄌ崛⊙逯械腄NA。待檢血清50μl加入含4mol/L異硫氰酸胍的裂解液 60ml，37℃溫育 10min；加入酚/氯仿/異戊醇 (25:24:1)50μl，震蕩混勻后13000r/min離心10min；取上清，加入等量異丙醇，-20℃沉淀2h，13000r/min離心10min，棄上清，室溫干燥后加入雙蒸水 20μl溶解，-20℃保存。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)：檢索GenBank收錄的HBV基因全序，采用Primer Premier5.0及Oligo 6.67軟件輔助分析，設(shè)計(jì)巢式PCR引物(外引物：P1、P2，內(nèi)引物：ADVup、ADVlow)；旨在使野生株(rt236N、rtA181V)PCR產(chǎn)物中含有Dral酶切位點(diǎn)(5TTTAAA3)而變異株無此限制性酶切位點(diǎn)。

1.3.3 PCR反應(yīng) 以血清提取物為模板進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)：30μl PCR反應(yīng)體系含Taq酶1μ，10x擴(kuò)增緩沖液 3μl，25mol/L dNTP 0.12μl、50μmol/L 引物0.12μl；第一輪PCR模板為血清提取物6μl，引物為P1，P2；第二輪PCR模板為第一輪PCR 產(chǎn)物3μl，引物為ADVup、ADVlow。兩輪PCR循環(huán)溫度條件均為94℃ 3min，94℃ 10s，53℃ 30s，72℃ 30s，共 30 循環(huán)，72℃ 7min。取第二輪PCR產(chǎn)物8μl，以10%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后于紫外燈下觀察結(jié)果，于304bp處出現(xiàn)熒光條帶為陽性。

1.3.4 Dra I酶切 10μl酶切反應(yīng)體系內(nèi)含第二輪PCR 產(chǎn)物 8μl，Dra I 10U，酶切緩沖液 1μl，于 37℃酶切4h。

1.3.5 瓊脂糖凝膠電泳 將9μl酶切產(chǎn)物以3%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后于紫外燈下觀察結(jié)果。PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后野生株較變異株缺失19bp，故電泳速度稍快，將標(biāo)本同對(duì)照質(zhì)粒相比較即可是否變異。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用均數(shù)比較t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

95例慢性乙肝患者接受ADV后，在不同治療階段檢測(cè)累計(jì)基因變異情況見表1。

表1 不同治療階段檢測(cè)基因變異病例數(shù)

3 討論

慢乙肝是我國(guó)最常見的慢性傳染性疾病，也是危及我國(guó)人群健康重要因素之一。目前對(duì)乙肝患者治療尚無特效藥物。部分患者可通過抗病毒治療抑制或清除乙型肝炎病毒。既往報(bào)道提示[2]，抗病毒的應(yīng)答與感染者個(gè)體因素以及病毒本身基因特性有關(guān)。長(zhǎng)期用藥可導(dǎo)致藥物靶位單核苷酸變異，即基因變異，從而使病毒在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生耐藥。通常通過對(duì)治療中發(fā)生病毒學(xué)突破的患者治療前后HBV株的核苷酸及其編碼的氨基酸比較分析而確定是否存在基因型耐藥，然而阿德福韋酯只要1個(gè)位點(diǎn)突變就足以發(fā)生突變[3]。孫華寶等[4]認(rèn)為基因變異不僅會(huì)引起病毒對(duì)該藥物耐藥，還可能導(dǎo)致病情的加重，故HBV基因變異的檢測(cè)有重要的臨床意義。

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)95例慢性乙肝患者在接受ADV治療的不同階段進(jìn)行rtN236T變異和rtA181V變異的檢測(cè)，結(jié)果顯示療程大于六個(gè)月即可產(chǎn)生基因變異，并隨著療程的延長(zhǎng)，其變異率不斷增加，即12、18、24個(gè)月變異率分別為 3.16%、6.32%、7.37%，研究提示阿德福韋治療對(duì)HBV可產(chǎn)生一定的基因變異，與用藥療程有一定相關(guān)性。另國(guó)外研究者發(fā)現(xiàn)[5，6]，隨著阿德福韋酯治療療程的延長(zhǎng)阿德福韋酯耐藥株也隨之出現(xiàn)，服用阿德福韋酯治療1～5年發(fā)生耐藥為 0、2～3%、519～11%、18%、28%。二者比較可見，一方面提示阿德福韋治療對(duì)HBV可產(chǎn)生基因變異與療程相關(guān)；另從另一個(gè)側(cè)面反映了ntPCRRFLP的靈敏性。此結(jié)果與李金明等[6]報(bào)道的使用基因芯片技術(shù)檢測(cè)ADV治療致乙肝病毒產(chǎn)生基因變異率大致相符。

目前，阿德福韋還是一種新的抗HBV藥物，在臨床使用時(shí)間還較短，關(guān)于阿德福韋的研究還主要側(cè)重于耐藥發(fā)生率、發(fā)生時(shí)間即耐藥對(duì)病情和病毒復(fù)制的影響等方面的研究，至于阿德福韋應(yīng)用與病毒變異之間的關(guān)系及發(fā)現(xiàn)方便、快捷的檢測(cè)方法等仍需進(jìn)一步研究、探討。建立一個(gè)良好的監(jiān)測(cè)機(jī)制、減少耐藥性及耐藥后相應(yīng)對(duì)策的實(shí)施等有重要意義。

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