周 琳，張連峰，李偉芳，史成章

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化科，河南鄭州450052

由于早期診斷率低，多數(shù)胰腺癌在診斷時已處于中晚期，能夠手術(shù)切除的病例不足10%［1］。近年來聯(lián)合應(yīng)用化學(xué)治療和分子靶向藥物治療日益受到人們的關(guān)注。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶Ⅱ(ACE2)是近年來發(fā)現(xiàn)的腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)新成員。新近的一些研究證實ACE2的表達缺失可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，而且初步證實ACE2可能是一個抑癌基因［2］。我們先前的研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織中存在ACE2表達下調(diào)甚至缺失，且 ACE2可抑制胰腺癌細胞增殖，提示ACE2功能缺失參與了胰腺癌的發(fā)病過程［3］。本研究通過建立穩(wěn)定高表達ACE2的胰腺癌細胞株，旨在探討ACE2在體外對胰腺癌細胞化學(xué)治療敏感性的影響，并初步探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞和細胞培養(yǎng) 人胰腺癌細胞株SW1990購自中科院上海細胞生物研究所，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，在37℃、5%CO2飽和濕度條件下傳代培養(yǎng)，每天換液以保證細胞濃度維持在(2～4)×105的最佳生長狀態(tài)，臺盼藍檢測細胞活力＞90%，選用對數(shù)生長期細胞進行實驗。吉西他濱(美國Lilly公司)溶解于無菌PBS中，制備為100 μmol/L儲備溶液，4℃保存。

1.2 細胞轉(zhuǎn)染 ACE2表達質(zhì)粒(pReceiver-M02-ACE2)與空白對照質(zhì)粒(pReceiver-M02-GFP)由課題組前期構(gòu)建。按照Polifect轉(zhuǎn)染試劑盒(美國Qiagen公司)說明書操作，具體方法:轉(zhuǎn)染前一天將3×105細胞接種到6孔板中。轉(zhuǎn)染時將ACE2質(zhì)粒和對照質(zhì)粒DNA 各 0.4 μg/孔和 10 μL Polifect轉(zhuǎn)染試劑混合，加入500 μL/孔Optimen無血清培養(yǎng)液，孵育4 h，之后更換為完全培養(yǎng)液，細胞在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.3 建立穩(wěn)定高表達ACE2基因細胞株 細胞轉(zhuǎn)染24 h后換液，48 h后加入400 μg/mL G418的細胞培養(yǎng)液，篩選克隆;4周后，待穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ACE2及空白對照質(zhì)粒的SW1990細胞克隆形成后，挑取克隆(分別命名為SW1990/ACE2和SW1990/GFP)，培養(yǎng)在含200 μg/mL G418的培養(yǎng)液中維持生長和傳代。

1.4 Western印跡 細胞離心沉淀后加入裂解液(RIPA，上海申能博采)，RC-DC法蛋白定量(美國Bio-Rad公司)。取30 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜(Bio-Rad公司)，先后與特異性抗ACE2多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)和抗β-actin單克隆抗體(美國Sigma公司)、辣根過氧化物酶連接的二抗(Santa Cruz公司)孵育，ECL(Amersham Biosciences公司)顯影。

1.5 MTT法檢測細胞增殖抑制率 使用CCK-8試劑盒(日本Dojindo公司)，通過檢測WST-8的剪切水平(OD450吸光值)觀察ACE2對細胞增殖的影響，具體方法如下:取未轉(zhuǎn)染組、陰性對照組及實驗組的SW1990細胞進行檢測。將5×103細胞接種于96孔板，每組細胞分別給予10、20、50 μmol/L濃度的吉西他濱干預(yù)24 h，每組設(shè)6個復(fù)孔，每孔加入100 μL培養(yǎng)液。細胞培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)孵育4 h，用酶標儀測定溶液在450 nm處的吸光度。增殖抑制率(%)=(1-處理孔A 450 nm/對照孔A 450 nm)×100%。

1.6 胰腺癌細胞的凋亡檢測

1.6.1 細胞凋亡的TUNEL法檢測:使用Roche公司的TUNEL試劑盒檢測細胞凋亡。收集各組細胞，按5×103/孔接種于含小玻片的6孔板內(nèi)，每組細胞分別給予50 μmol/L濃度的吉西他濱干預(yù)，每組設(shè)3復(fù)孔，孵育48 h，取出玻片，PBS輕洗后，按試劑盒說明書進行操作，DAB染色。凋亡細胞表現(xiàn)為細胞核綠色熒光。選擇隨機5個40×視野，凋亡率(%)=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.6.2 流式細胞儀:每組細胞分別給予50 μmol/L濃度的吉西他濱處理48 h，收集細胞于1.5 mL離心管中，用加冰預(yù)冷的PBS洗2次，以少量PBS懸浮細胞，細胞濃度為1×106/mL。取100 μL細胞懸液加入5 μL膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(AnnexinⅤ-FITC)、100 μg 碘化丙啶(PI，250 μg/mL，Sigma 公司)室溫避光反應(yīng)30 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，多組間均值的兩兩比較采用SNK法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ACE2在胰腺癌細胞中的表達 Western印跡結(jié)果顯示，ACE2蛋白在SW1990和SW1990/GFP細胞中均有微弱表達，在SW1990/ACE2細胞中的表達水平明顯強于陰性對照及未處理組(見圖1)。取ACE2灰度/β-actin灰度比值得出ACE2相對表達強度，結(jié)果顯示在蛋白水平，SW1990、SW1990/GFP和 SW1990/ACE2的 ACE2值分別為 0.231±0.041、0.216±0.033、0.865±0.162，SW1990/ACE2中 ACE2蛋白水平明顯高于SW1990和SW1990/GFP(P＜0.05)。上述結(jié)果證明穩(wěn)定高表達ACE2的胰腺癌細胞株構(gòu)建成功。

圖1 不同處理組SW1990細胞中ACE2蛋白的表達 A:SW1990;B:SW1990/GFP;C:SW1990/ACE2Fig 1 Western blot analysis showing expression of ACE2 in SW1990 cells after they had been infected with an adenovirus containing

2.2 MTT法檢測細胞增殖抑制率 不同濃度(10、20、50 μmol/L)吉西他濱干預(yù)3種細胞24 h，細胞增殖抑制率呈劑量依賴性增高。SW1990/ACE2分別為(19.6±2.7)%、(29.3±4.2)%和(51.2±4.8)%，SW1990/GFP分別為(11.1±1.3)%、(15.2±1.6)%和(24.2±3.3)%，SW1990細胞分別為(12.6±1.7)%、(17.7±1.4)%和(21.3±2.6)%。在各個濃度階段，吉西他濱對SW1990/ACE2細胞抑制率均明顯高于ACE2和ACE2/GFP細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。SW1990和SW1990/GFP間細胞抑制率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。表明穩(wěn)定過表達ACE2可增加胰腺癌細胞對吉西他濱的敏感性。

2.3 胰腺癌細胞凋亡檢測

2.3.1 TUNEL法:吉西他濱(50 μmol/L)干預(yù)24 h后，SW1990/ACE2凋亡率達(17±2)%，明顯高于SW1990(8±1)%和SW1990/GFP(11±3)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。統(tǒng)計分析表明轉(zhuǎn)染ACE2表達質(zhì)粒后，SW1990細胞的凋亡率升高(見圖2)。

圖2 TUNEL檢測吉西他濱干預(yù)24 h后實驗組細胞的凋亡，凋亡細胞核斷端被原位特異標記(40×)Fig 2 Analysis of apoptosis using TUNEL in SW1990 pancreatic cancer cells stably expressed ACE2 after treatment with gemcitabin for 24 h.DNA fragmentation were detected by labeling the terminal end of nucleic acids(40×)

2.3.2 流式細胞儀雙染法檢測:吉西他濱(50 μmol/L)干預(yù)24 h后，SW1990/ACE2凋亡率達(31.2±3.8)%，與 SW1990和 SW1990/GFP比較［(17.6±2.3)%和(15.9±1.7)%］差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);SW1990和SW1990/GFP比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。表明ACE2可增加吉西他濱誘導(dǎo)胰腺癌細胞的凋亡率。

3 討論

盡管目前胰腺癌的治療仍以手術(shù)為主，但由于切除率低下且預(yù)后不佳，以化學(xué)治療為基礎(chǔ)的綜合治療已成為中晚期胰腺癌治療的最佳方案。吉西他濱是抗進展期胰腺癌化學(xué)治療的一線藥物，可作用于DNA合成期的腫瘤細胞，即S期細胞，在一定條件下阻止其從G1期向S期進展［4］。吉西他濱在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)化成吉西他濱磷酸鹽，后者可使DNA鏈合成停止，進而DNA斷裂、細胞死亡，發(fā)揮抗癌作用。

ACE2作為腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)新成員，是目前發(fā)現(xiàn)的第一個，也是唯一一個 ACE的同工酶［5］。人類 ACE2的基因定位于 Xp22，基因全長39.98 kb，由18個外顯子和20個內(nèi)含子組成，蛋白分子量為92.5 KD。ACE2廣泛分布于人體的各個組織，在心臟、腎臟、睪丸、胃腸道和肺臟等部位都有表達。ACE2通過水解AngⅠ羧基端脯氨酸與苯丙氨酸之間的肽鍵，生成Ang-(1-7)，Ang-(1-7)通過其特異性Mas受體及與激肽系統(tǒng)的交互作用發(fā)揮其拮抗AngⅡ的作用。與ACE有所不同，ACE2具有舒張血管平滑肌的抗高血壓作用。由于ACE2可削弱甚至拮抗AngⅡ促進細胞增殖的效應(yīng)，近年來其在腫瘤細胞中的生物學(xué)效應(yīng)日漸受到關(guān)注。Feng等將ACE2表達載體轉(zhuǎn)染非小細胞肺癌細胞株A549，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ACE2可抑制血管內(nèi)皮生長因子的表達(VEGF)及肺癌細胞的增殖［2］。我們已完成的研究發(fā)現(xiàn):與癌旁正常胰腺組織標本的胰腺導(dǎo)管細胞相比，導(dǎo)管癌細胞中ACE2蛋白僅有微弱表達;進一步研究發(fā)現(xiàn)，通過小干擾RNA技術(shù)封閉胰腺癌細胞株中ACE2的表達后，胰腺癌細胞的增殖明顯加強［3］。以上結(jié)果提示，ACE2在不同種類的癌細胞中均可抑制其異常增殖，胰腺癌中存在著因ACE2下調(diào)導(dǎo)致的功能缺失。

在吉西他濱作用下，SW1990/ACE2組細胞的生長抑制作用強于其他兩組，且各組細胞對藥物引起的生長抑制作用有明顯的劑量依賴性。近年來的研究表明，多種抗腫瘤藥物均可導(dǎo)致不同程度的細胞凋亡，細胞的增殖、分化、凋亡三者間的平衡失調(diào)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。國外的一些研究提示，吉西他濱可通過線粒體依賴的通路誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡［6］。在本實驗中，我們通過TUNEL法和流式雙染AnnexinⅤ/PI法檢測到ACE2可誘導(dǎo)胰腺癌細胞的凋亡，且吉西他濱誘導(dǎo)SW1990/ACE2細胞凋亡的作用最強，提示穩(wěn)定高表達ACE2的胰腺癌細胞對吉西他濱的敏感性增強，兩者有聯(lián)合作用。以上實驗結(jié)果表明，ACE2和吉西他濱在體外聯(lián)合作用于SW1990細胞，無論在抑制細胞的增殖方面，還是誘導(dǎo)凋亡方面，均有明顯的協(xié)同作用。

綜上所述，本研究顯示ACE2可明顯增強吉西他濱對胰腺癌細胞對化學(xué)治療的敏感性，其機制涉及抑制細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡等多個方面，為基因和化學(xué)藥物的聯(lián)合治療提供新的思路。ACE2有望成為胰腺癌治療的靶點，值得進一步深入探討。

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