李 健，吳佳慧，黎晨晨

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，哈爾濱 150076)

豆角作為膳食蛋白質(zhì)的重要來(lái)源，其中毒事件的頻繁發(fā)生使很多人對(duì)其食用的安全性產(chǎn)生了置疑［1］.目前僅我國(guó)國(guó)內(nèi)的豆角品種就多達(dá)數(shù)千種，由于毒素成分復(fù)雜而難以進(jìn)行全面系統(tǒng)的研究調(diào)查［2］.國(guó)內(nèi)外對(duì)以上方面的研究報(bào)道極為少見(jiàn).當(dāng)前國(guó)內(nèi)外學(xué)術(shù)界一般認(rèn)為，豆角中主要含有血細(xì)胞凝集素和皂苷兩種毒素［3］.皂苷是苷類(lèi)中結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的化合物.它們廣泛存在于植物體內(nèi)，種類(lèi)繁多，組成復(fù)雜［4］.前期確定了豆角皂苷的提取工藝，本實(shí)驗(yàn)采用大孔樹(shù)脂純化分離等手段，以得率和質(zhì)量比為主要考查指標(biāo)，就豆角皂苷的提取分離純化進(jìn)行研究，旨在能給豆角皂苷的結(jié)構(gòu)研究提供一些可參考的微觀指標(biāo)和實(shí)驗(yàn)的依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料:溶劑浸提超聲輔助法制得的豆角皂苷粗提液

試劑:人參皂苷Rg1，購(gòu)于黑龍江省藥檢所;D101型大孔吸附樹(shù)脂;無(wú)水乙醇、甲醇、氫氧化鈉、鹽酸、香草醛、冰乙酸、高氯酸等均為分析純?cè)噭?

1.2 儀器與設(shè)備

植物粉碎機(jī)FZ102型 天津泰斯特儀器有限公司;電子天平FA2004N 上海精密科學(xué)儀器有限公司;RE52－98旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;KQ型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;722E分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司.

2 實(shí)驗(yàn)方法與步驟

2.1 豆角皂苷靜態(tài)吸附及解吸實(shí)驗(yàn)

1)靜態(tài)吸附方法

精確稱(chēng)取經(jīng)預(yù)處理6 g的濕樹(shù)脂3份，置于具塞磨口三角瓶中，加入豆角皂苷質(zhì)量比為4.314mg/g的豆角皂苷粗提液各50mL，蓋緊瓶塞，于室溫下振蕩，充分吸附后過(guò)濾，測(cè)定濾液中剩余皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)，按下式計(jì)算吸附率和吸附量:

其中:C0為吸附前質(zhì)量濃度(mg/mL);Ce為吸附后質(zhì)量濃度(mg/mL);E為吸附率(%);Q為吸附量(mg/g);V為溶液體積(mL);W為樹(shù)脂干重(g).

2)靜態(tài)解吸方法

向?yàn)V去吸附液并達(dá)到吸附平衡的樹(shù)脂中加入50mL 70%的乙醇，室溫下連續(xù)振蕩，充分解吸后過(guò)濾，測(cè)定濾液的皂苷質(zhì)量濃度，按下式計(jì)算解吸率:

其中:C1為解吸后溶液質(zhì)量濃度(mg/mL);V1為解吸后溶液體積(mL);C0為吸附前溶液質(zhì)量濃度(mg/mL);Ce為吸附后溶液質(zhì)量濃度(mg/mL);V為吸附液體積(mL).

2.2 豆角皂苷動(dòng)態(tài)吸附及解吸實(shí)驗(yàn)

1)上樣pH值的確定

將豆角皂苷粗提物水溶液調(diào)至不同的pH值，上柱，靜置一段時(shí)間后，測(cè)定流出液的皂苷質(zhì)量比，計(jì)算吸附量，確定吸附液的最適pH值.

2)洗脫劑及其體積分?jǐn)?shù)的選擇

準(zhǔn)確吸取一定量的提取液上柱，靜置后，先用水洗脫，再依次用同體積的20% ～90%的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液并測(cè)定其中皂苷的體積分?jǐn)?shù)，以確定最佳的洗脫劑體積分?jǐn)?shù).

3)最佳吸附時(shí)間的確定

將豆角皂苷的粗提取液加入到樹(shù)脂柱中，靜置20、30、40、50、60、70、80min 時(shí)間后，測(cè)定流出液的總皂苷質(zhì)量比，確定最佳的解析時(shí)間.

4)最佳上樣量的確定

將精確稱(chēng)取的10 g濕樹(shù)脂裝柱后，取不同于樹(shù)脂體積比例為 1、2、4、6、8、10、12 的豆角皂苷粗提液吸附一定時(shí)間，通過(guò)對(duì)流出液中的總皂苷質(zhì)量比的測(cè)定，確定最佳上樣量.

5)洗脫劑用量的確定

精確吸取一定量提取液上柱，靜置一定時(shí)間后，依次用蒸餾水，低體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液，再用與樹(shù)脂體積比為2、4、6、8、10、12 的乙醇溶液進(jìn)行解吸，測(cè)定流出液總皂苷質(zhì)量比，計(jì)算解吸率，確定洗脫劑的最佳用量.

6)最佳解吸時(shí)間的確定

將達(dá)到吸附飽和的樹(shù)脂用蒸餾水沖洗，用一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇洗脫，洗脫液每10min收集1次，收集8份，測(cè)定總皂苷質(zhì)量比，確定解吸時(shí)間.

2.3 豆角總皂苷質(zhì)量比的測(cè)定方法

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

人參皂苷Rg1標(biāo)準(zhǔn)液的配制:準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥至恒重的人參皂苷Rg1標(biāo)準(zhǔn)品5.0mg，加甲醇溶解并定容至10mL，搖勻.分別準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.060、0.120、0.180、0.240、0.300、0.360mL 于具塞試管中，水浴揮干溶劑，加入新配制的5%香草醛－冰乙酸溶液0.20mL，高氯酸0.80mL，蓋塞，混勻，在60℃水浴中加熱25min，冰水冷卻5min，加入冰醋酸5mL，搖勻，靜置10min，在波長(zhǎng)546 nm處測(cè)定吸光度，進(jìn)行空白對(duì)照.以皂苷質(zhì)量比為縱坐標(biāo)，吸光度(A)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得回歸方程:y=0.2485 x－0.0012(R2=0.9981)

圖1 人參皂苷Rg1標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.2 豆角皂苷質(zhì)量比測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取豆角總皂苷提取物10.0mg，加甲醇定容至10mL，搖勻.準(zhǔn)確移取0～20mL于具塞試管中，其余步驟與標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法相同，測(cè)其吸光度［5－6］.

皂苷質(zhì)量比(mg/g)=測(cè)得豆角皂苷質(zhì)量比/所用脫脂豆角粉量

3 結(jié)果與討論

3.1 豆角皂苷靜態(tài)吸附及解吸實(shí)驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)計(jì)算得出D101型大孔樹(shù)脂的吸附量約為38.56mg/g(樹(shù)脂)，解析率約為 86.84%.

3.2 動(dòng)態(tài)吸附及解吸的最佳條件

1)上樣pH值

結(jié)果見(jiàn)圖2，當(dāng)pH值呈弱堿性時(shí)，大孔樹(shù)脂對(duì)豆角皂苷的選擇吸附性能好(色素吸附少，有明顯的脫色效果)，這可能和豆角皂苷是非離子性物質(zhì)有關(guān).在提取豆角皂苷時(shí)，色素也會(huì)被抽提出來(lái)，這些色素多為酚類(lèi)物質(zhì)，和豆角皂苷極性相似，難以分離.在堿性條件下，色素轉(zhuǎn)換為鹽而溶于水，不易被樹(shù)脂吸附;另外，豆角皂苷在堿性條件下比較穩(wěn)定，因此，豆角皂苷溶液的pH值選8.

2)最佳吸附時(shí)間

將調(diào)好pH值為8的提取液以1.0mL/min的流速加入到樹(shù)脂柱中，靜置不同時(shí)間，測(cè)定流出液的總皂苷質(zhì)量比，結(jié)果見(jiàn)圖3.如圖3所示，靜置時(shí)間為40～70min時(shí)吸附曲線呈上升趨勢(shì)，而后即趨勢(shì)平緩.時(shí)間過(guò)短吸附不完全，用水沖洗時(shí)，皂苷成分會(huì)被帶走，因而吸附率較低;而時(shí)間過(guò)長(zhǎng)又將難以解吸.原因是吸附是以物理吸附為主、伴隨化學(xué)吸附的過(guò)程，進(jìn)行的較慢，當(dāng)時(shí)間為70min時(shí)吸附即達(dá)到平衡.因此靜置時(shí)間70min為吸附最佳點(diǎn).

3)洗脫劑體積分?jǐn)?shù)

選擇D101大孔樹(shù)脂濕法裝柱，將豆角皂苷溶液調(diào)成pH值為8過(guò)柱，吸附飽和后，先用蒸餾水水洗脫，然后選用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇進(jìn)行解吸.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4.由圖4可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%～30%時(shí)，洗脫液中皂苷很少;當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50% ～70%時(shí)，洗脫液中皂苷質(zhì)量比較高;而當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%或更大時(shí)，洗脫液中皂苷質(zhì)量比逐漸減少.其中以70%的乙醇洗脫液中的皂苷質(zhì)量比最高.因此優(yōu)選的洗脫條件為依次用蒸餾水，20%乙醇溶液及70%乙醇溶液進(jìn)行洗脫，收集70%乙醇的洗脫液.

圖4 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)皂苷質(zhì)量比的影響

4)最佳上樣量

在樹(shù)脂柱中加入不同量的豆角皂苷粗提液，吸附70min后，測(cè)定解析液中總皂苷的質(zhì)量比.結(jié)果如圖5所示，隨著上樣量的增加，吸附率呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì).在二者比例為1～8時(shí)，下降趨勢(shì)緩慢;繼續(xù)增大比例，吸附率下降幅度增大，此時(shí)已超過(guò)了樹(shù)脂的飽和吸附量，已有部分皂苷成分損失.而上柱量太少，純化周期過(guò)長(zhǎng)，因此從出于對(duì)實(shí)驗(yàn)周期和濟(jì)因素考慮，吸附液量與樹(shù)脂的最佳比例為8∶1.

圖5 上樣液量對(duì)吸附率的影響

5)洗脫劑的體積

在吸附飽和的大孔樹(shù)脂柱中，先用水洗脫，再用20%乙醇溶液洗脫，最后加入不同體積的70%的乙醇溶液測(cè)定洗脫液中總皂苷質(zhì)量比，計(jì)算解吸率，結(jié)果見(jiàn)圖6.由圖6可知，隨著洗脫劑用量的增大，解吸率提高，但當(dāng)洗脫劑量大于8時(shí)解吸率的增大幅度已不明顯，從節(jié)省溶劑的角度考慮，選擇洗脫劑乙醇的量與樹(shù)脂體積比例為8∶1.

圖6 洗脫劑用量對(duì)解析率的影響

6)最佳解析時(shí)間

在吸附飽和的樹(shù)脂柱中，先用水洗脫，再用20%乙醇洗脫，最后用加入8倍于樹(shù)脂量70%乙醇進(jìn)行洗脫，測(cè)定靜置不同時(shí)間的洗脫液皂苷質(zhì)量比，結(jié)果見(jiàn)圖7.如圖7所示，隨著解析時(shí)間的增加，皂苷量也逐漸增大，在解吸時(shí)間達(dá)到60min后質(zhì)量比無(wú)明顯增加，這時(shí)解吸基本完全，出于對(duì)純化周期的考慮，將最佳解吸時(shí)間定為為60min.

圖7 解析時(shí)間對(duì)皂苷質(zhì)量比的影響

4 結(jié)語(yǔ)

綜上可知，豆角總皂苷純化的最佳工藝條件為:上樣pH值為8，上樣液量為8倍樹(shù)脂體積，吸附70min，依次用蒸餾水、20%乙醇溶液、8倍樹(shù)脂體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，解析60min后，收集70%乙醇的洗脫液，減壓濃縮后真空干燥得到豆角皂苷純化物.經(jīng)過(guò)大孔樹(shù)脂純化后豆角總皂苷純化物的純度為54.61%，比豆角皂苷純度提高了28.47%，為接下來(lái)豆角皂苷的繼續(xù)精制及其結(jié)構(gòu)研究奠定了基礎(chǔ).

［1］劉清福，梅燕山，梁慧峰.FTIR光譜法定性鑒別有毒豆角［J］.光譜實(shí)驗(yàn)室，2002，19(6):816－818.

［2］吳從周，曹純庵，葉 林.豆角中毒的流行病學(xué)調(diào)查及其毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)［J］.中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，1999，21(3):137－138.

［3］馬龍江.濟(jì)寧市10起學(xué)校豆角中毒調(diào)查［J］.中國(guó)學(xué)校衛(wèi)生，2001，22(2):168.

［4］GIUSEPPE M，VINCENZO O S，ANTONIETTA D A，et al.HPLC analyses of seed storage proteinsreveal polymorphism in I-talian common bean(Phaseolus vulgaris L.)ecotypes［J］.Euphytica，2003，134:85－95.

［5］劉 寧，李 健，金龍哲.超聲波法提取豆角總皂苷的工藝研究［J］.食品科學(xué)，2008，29(10):327－329.

［6］孟 雪，吳 春.大孔樹(shù)脂分離純化玉米苞葉總黃酮方法研究［J］.哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2011，27(3):284－286，291.