周倩倩，丁 叢，王志平，蔡偉民

(上海交通大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200240)

苯酚(C6H6O)，又名石炭酸、羥基苯，是最簡單的酚類有機(jī)物，其密度為1.071 g/cm3，熔點(diǎn)42～43℃，沸點(diǎn)182℃，在常溫下微溶于水、乙醚、氯仿、甘油和二硫化碳，幾乎不溶于石油醚［1－2］.

作為重要的化工原料，苯酚及其衍生物被廣泛應(yīng)用于酚醛樹脂、造紙、煉油、焦炭、染料、紡織、殺蟲劑、農(nóng)藥和醫(yī)藥合成等行業(yè)生產(chǎn)中［3－4］，并成為這些工業(yè)廢水中的主要污染物，其在焦化廠和煤氣廠廢水中含量(揮發(fā)酚)可達(dá)1600～3200mg/L［5］.酚類化合物是原型質(zhì)高毒類物質(zhì)，具有三致效應(yīng)，美國環(huán)境保護(hù)署(EPA)把苯酚列入129種優(yōu)先控制污染物和65種有毒污染物之列，我國也把苯酚列入中國環(huán)境優(yōu)先污染物“黑名單”之中［6］.我國污水綜合排放標(biāo)準(zhǔn)(GB8978－1996)規(guī)定，揮發(fā)酚的一級標(biāo)準(zhǔn)、二級標(biāo)準(zhǔn)和三級標(biāo)準(zhǔn)分別為0.5、0.5、2.0mg/L.

含酚廢水的處理方法有很多種［7］，微生物降解法因其效果好、成本低、無二次污染等優(yōu)點(diǎn)而在應(yīng)用中發(fā)揮著日益重要的作用［8］.為此，近些年來，研究人員在含酚廢水微生物處理方面進(jìn)行了大量研究［9－11］，明確了生物法的關(guān)鍵在于高效破酚菌的馴化與應(yīng)用.在降酚微生物菌種的研究中，熱帶假絲酵母因其高效降解性逐漸成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)［12］.本文以實(shí)驗(yàn)室前期培養(yǎng)的苯酚降解好氧顆粒污泥為主體，采用選擇性培養(yǎng)基從中分離出了一株降酚菌，它的高苯酚耐受度與高效的苯酚降解率，在其他文獻(xiàn)很罕見.針對影響其降解苯酚的因素開展了系列研究，以明確好氧顆粒污泥的降酚機(jī)理及其操作工藝優(yōu)化，為好氧顆粒污泥工藝用于含酚廢水處理提供理論支持.

1 材料和方法

1.1 菌源

實(shí)驗(yàn)室前期培養(yǎng)的苯酚降解顆粒污泥，經(jīng)粉碎、懸浮后于YEPD培養(yǎng)基中培養(yǎng).

1.2 培養(yǎng)基的制備

1.2.1 固體培養(yǎng)基

1)虎紅瓊脂培養(yǎng)基(Rose Bengal medium)

虎紅瓊脂培養(yǎng)基31 g/L(含13 g/L瓊脂)，補(bǔ)至瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.8%.培養(yǎng)基在121℃濕熱滅菌20min后制成平板，倒置晾干于超凈工作臺備用.

2)PDA固體培養(yǎng)基(Potato Dextrose Agar medium)

馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂18 g/L.培養(yǎng)基在121℃濕熱滅菌20min后制成平板，倒置晾干于超凈工作臺備用.

1.2.2 富集培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基采用YEPD培養(yǎng)基(YEPD medium):酵母提取物(Yeast extract)10 g/L，蛋白胨(peptone)20 g/L，葡萄糖(Dextrose)20 g/L.培養(yǎng)基在121℃濕熱滅菌20min后備用.1.2.3 無機(jī)鹽培養(yǎng)基

無機(jī)鹽培養(yǎng)基(NMS medium):(NH4)2SO40.5 g/L，NH4NO31.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KH2PO40.5 g/L，K2HPO41.5 g/L，CaCl20.01g/L，微量元素1mL/L.121℃濕熱滅菌20min后備用.

(微量元素液:FeSO40.1 g/L，ZnSO40.1g/L，AlK(SO4)20.01 g/L，Na2MoO40.01 g/L，CoCl20.1 g/L，CuSO40.01 g/L，H3BO40.01 g/L)

1.3 儀器與設(shè)備

主要儀器設(shè)備包括熒光相差顯微鏡(Nikon E400)、高速臺式冷凍離心機(jī)(德國SIGMA 3－18K型)、低速臺式離心機(jī)(Anke KA－1000型)、超凈工作臺(哈爾濱市東聯(lián)公司FLC－3型)、紫外－可見分光光度計(jì)(Unico UV－2102PCS型)、恒溫振蕩培養(yǎng)箱(上海常思工貿(mào)有限公司)、微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司XW－80A型)、精密pH計(jì)(上海雷磁儀器廠 PHS－3C)、生化培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司 SHP－250型)等.苯酚(Phenol，crystalline，ultra pure)購于上海生工生物工程有限公司.

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 苯酚降解優(yōu)勢菌的選育

1)菌種富集

取活性顆粒污泥50mL到含有200mg/L苯酚的150mL無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，并加入5粒玻璃珠，于30℃、120 r/min搖床中培養(yǎng)，24 h后取50mL轉(zhuǎn)移至含有400mg/L苯酚的150mL無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，依次逐步提高培養(yǎng)基中的苯酚質(zhì)量濃度至1200mg/L，共5個(gè)周期，120 h.最后取培養(yǎng)液進(jìn)行一系列稀釋后涂布于苯酚質(zhì)量濃度為1000mg/L的無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基平板上，置于生化培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng).

2)菌種的純化分離.

將馴化后所得混合菌株采用平板劃線和涂布法進(jìn)行純化分離.在無菌操作條件下挑取菌落，劃線及以10－3、10－4和 10－5的質(zhì)量濃度梯度涂于虎紅瓊脂培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基上，通過比較菌落特征(包括菌落大小、形狀、顏色，隆起形態(tài)，邊緣特征等)將菌株初步分類，再通過熒光相差顯微鏡(Nikon E400)將菌株進(jìn)行進(jìn)一步區(qū)分.將分離出來的菌種反復(fù)純化3次后，挑取高度分散的單菌落至培養(yǎng)基斜面上劃線培養(yǎng)，待斜面上形成菌苔后置于4℃的冰箱中保存?zhèn)溆?

3)菌種的篩選

先將菌種在無菌條件下接種到50mL富集培養(yǎng)基中，在溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為120 r/min的恒溫振蕩搖床中培養(yǎng)12 h;取培養(yǎng)液3mL轉(zhuǎn)接于100mL富集培養(yǎng)基中，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)12 h.取菌液90mL，在10000 r/min條件下離心5min，棄上清液后用無機(jī)鹽培養(yǎng)基洗脫菌體3次，以去除菌體表面吸附的YEPD培養(yǎng)基.再將得到的菌體用無機(jī)鹽培養(yǎng)基配成菌懸液，以3%(V/V，下同)的接菌量接種到含1000mg/L苯酚的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于30℃、120 r/min恒溫?fù)u床中繼續(xù)振蕩培養(yǎng).通過檢測菌株細(xì)胞生長量和苯酚殘余質(zhì)量濃度的變化考察菌體對苯酚的降解利用狀況.篩選出1株苯酚降解優(yōu)勢菌并進(jìn)行菌種鑒定.

1.4.2 優(yōu)勢菌的苯酚耐受試驗(yàn)

配制分別含 500、750、1000、1250、1500、1750、2000、2250mg/L苯酚的無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基，將篩選出的苯酚降解優(yōu)勢菌分別在這8個(gè)梯度的培養(yǎng)基上劃線，后置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.4.3 分析與檢測

1)菌株生長量的測定

采用比濁法以波長為560 nm處的光吸收值(OD560)代表培養(yǎng)液中的濁度，即微生物量，表征菌株的生長狀況［13］.

2)苯酚質(zhì)量濃度的測定

培養(yǎng)液中苯酚質(zhì)量濃度采用4－氨基安替吡啉直接吸光光度法［14］測定.

酚類化合物于pH值為10.0～10.2介質(zhì)中，在鐵氰化鉀存在下，與4－氨基安替比林反應(yīng)，生成橙紅色的跺酚安替比林染料，其水溶液在510 nm波長處有最大吸收.

3)苯酚降解率的計(jì)算

1.4.4 環(huán)境因子對菌株生長及其降酚效果的影響

1)接菌量的影響

將配制的菌懸液分別以1%、3%、5%、7%的接菌量接種到含1000mg/L苯酚的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于30℃、120 r/min恒溫振蕩搖床中培養(yǎng).間隔6 h取樣，測其菌濁(菌株生長量)以及剩余苯酚質(zhì)量濃度.

2)苯酚初始質(zhì)量濃度的影響

根據(jù)苯酚耐受實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將配制的菌懸液以3%的接菌量分別接種到苯酚含量為750、1000、1250、1500、1750mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于30℃、120 r/min恒溫振蕩搖床中振蕩培養(yǎng).分別于24 h和36 h取樣，測其菌濁以及剩余苯酚質(zhì)量濃度.

3)pH值的影響

將配制的菌懸液以3%的接菌量接種到苯酚質(zhì)量濃度為1000mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，調(diào)pH值分別為 4.00、6.00、8.00、10.00，再以一組不調(diào)pH(已測 pH=6.85)為對照，于 30 ℃、120 r/min恒溫振蕩搖床中振蕩培養(yǎng).間隔6 h取樣，測其菌濁以及剩余苯酚質(zhì)量濃度.

4)溫度的影響

將配制的菌懸液以3%的接菌量接種到含1000mg/L苯酚的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，分別放置于溫度為20、25、30、35、40 ℃，振蕩速率均為 120 r/min恒溫振蕩搖床中振蕩培養(yǎng).于36 h取樣，測其剩余苯酚質(zhì)量濃度.

5)裝液量的影響

將配制的菌懸液以3%的接菌量接種到苯酚質(zhì)量濃度為1000mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)基體積分別為 50、75、100、125、150mL 的 250mL三角瓶中，在30℃、120 r/min恒溫振蕩搖床中振蕩培養(yǎng).于24 h取樣，測其剩余苯酚質(zhì)量濃度.1.4.5 外加碳源對菌株生長及其降酚能力的影響

選葡萄糖為外加碳源.將配制的菌懸液以3%的接菌量接種到含1000mg/L苯酚的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，分別加入質(zhì)量濃度為 0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L的葡萄糖，再以一組苯酚為惟一碳源為對照，置于溫度為30℃，振蕩速率為120 r/min恒溫振蕩搖床中振蕩培養(yǎng).間隔4 h取樣，測其菌濁以及剩余苯酚質(zhì)量濃度.

2 結(jié)果與分析

2.1 降酚菌的選育及鑒定

經(jīng)過馴化和反復(fù)涂布分離，從實(shí)驗(yàn)室前期降酚好氧顆粒污泥中分離出了18種苯酚降解菌株，分別標(biāo)記為1#至18#.用虎紅瓊脂培養(yǎng)基和PDA固體培養(yǎng)基劃線以及涂布后于4℃的冰箱中保存?zhèn)溆?

選取其中降解苯酚效果最好的1#菌株進(jìn)行苯酚耐受性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其在苯酚質(zhì)量濃度低于2000mg/L的培養(yǎng)基內(nèi)均能生長良好，經(jīng)大連寶生物工程公司采用23S rRNA測序鑒定，該菌株為熱帶假絲酵母屬(C.tropicalis).

2.2 接菌量的影響

接菌量對菌株生長及苯酚降解的影響如圖1、2.

從圖1可以看出，當(dāng)接菌量為1%時(shí)，菌株需要比較長的適應(yīng)期，在12 h之后菌濁(生物量)才有比較明顯的增長，而當(dāng)接菌量≥3%時(shí)，菌株只需要很短的適應(yīng)期即能進(jìn)入對數(shù)增長期.隨著微生物的增長，其中的苯酚被逐漸降解，各接種量下的試驗(yàn)水樣均有近似的菌濁，表明由培養(yǎng)基質(zhì)確定的微生物增長量基本相同.

試驗(yàn)中各接種樣的剩余苯酚質(zhì)量濃度如圖2所示.從圖2可以看出，實(shí)驗(yàn)初期由于微生物量較低，各試驗(yàn)樣的剩余苯酚質(zhì)量濃度相差不大，而由于菌株進(jìn)入對數(shù)生長期有所差異，其剩余苯酚質(zhì)量濃度出現(xiàn)明顯差別.接菌量高的試樣苯酚去除效率越高.接菌量≥3%的試樣在24 h內(nèi)均已基本完成試樣內(nèi)的苯酚降解，而接種1%的試樣則明顯延遲.在后續(xù)試驗(yàn)中，確定3%為最佳接菌量.

2.3 苯酚初始質(zhì)量濃度的影響

微生物降解有毒有機(jī)化合物時(shí)需考慮化合物質(zhì)量濃度本身對降解性能的影響［15］.

在初始苯酚質(zhì)量濃度對菌株利用苯酚的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，初始苯酚質(zhì)量濃度越高對微生物毒害越大，導(dǎo)致苯酚的降解越慢(圖3).24 h時(shí)，初始質(zhì)量濃度為750mg/L的苯酚降解已完全結(jié)束，質(zhì)量濃度為1000mg/L的苯酚降解率也已達(dá)到95%;而初始苯酚質(zhì)量濃度≥1250mg/L的試樣中，苯酚降解率急劇降低，1250mg/L的降解率僅為70%，1500mg/L和1750mg/L的更小于20%.36 h后，初始質(zhì)量濃度為1250mg/L的苯酚降解率也能達(dá)到98%，而1500mg/L的降解率僅76%，1750mg/L的降解率仍不及20%.因?yàn)閷?000mg/L質(zhì)量濃度的苯酚降解率幾乎為零，因此判斷此菌株對2000mg/L的高質(zhì)量濃度苯酚有耐受而無降解.在后續(xù)試驗(yàn)中，選取初始苯酚質(zhì)量濃度1000mg/L為該菌株降解苯酚的最適宜降解質(zhì)量濃度.

圖3 苯酚質(zhì)量濃度對苯酚降解的影響

2.4 pH值的影響

pH值是影響微生物降解苯酚的主要因素［16］，不僅會直接影響微生物的生長增殖，同時(shí)可能改變水體中苯酚的存賦形態(tài)［17］;它通過顯著影響苯酚降解過程中的一系列生化反應(yīng)，從而影響苯酚降解速率及效果［18］.不同pH值對菌株生長及利用苯酚的結(jié)果如圖4、5.

當(dāng)pH值介于4.00到8.00之間，菌株均能較好的生長，且對苯酚都有較好的降解.其中，不調(diào)pH(pH=6.85)時(shí)菌株生長最快，適應(yīng)期最短，24 h即完成了95%以上苯酚的降解;pH值為8.00時(shí)菌株生長情況和苯酚降解效果好于pH值為4.00和pH值為6.00時(shí);而當(dāng)pH值達(dá)到10.00時(shí)，菌株基本沒有增殖，其中的苯酚也基本未被利用.這是因?yàn)楦遬H值導(dǎo)致苯酚電離形成弱酸根離子，對微生物產(chǎn)生了嚴(yán)重的毒害作用.

降解24 h后重新測定pH值，發(fā)現(xiàn)除pH值初始為10.00的試樣以外，其他試樣均有所降低，這可能是由于苯酚降解過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物，如某些有機(jī)酸而引起的.在36 h后，pH值又有所上升，但未能恢復(fù)到pH值初始值，這與Ucun等人的研究結(jié)果一致［19］.由于苯酚利用過程中pH值會降低，因此推測中性偏堿的環(huán)境有利于菌株降解苯酚，這與試驗(yàn)中pH值為6.85及8.0的試樣有較好的降解效果相一致［20］.本菌株適應(yīng)pH值為4.00～8.00，最適pH值為中性稍偏堿.

2.5 溫度的影響

溫度影響微生物體內(nèi)的酶活性，在一定溫度范圍內(nèi)，降酚酶表現(xiàn)出最佳催化活性［21］.圖6反映的是在不同溫度下，接種量3%的菌株36 h后的苯酚降解率.從中可以看到，20℃和40℃下36 h后的苯酚降解率均低于20%，25℃下降解率仍僅為50%，而30℃與35℃條件下，菌株在36 h內(nèi)能完成100%的苯酚降解.因此，該菌株降解苯酚的適宜溫度為30～35℃，最適溫度為30℃.本研究溫度對該菌株降解苯酚有極大的影響，是影響苯酚降解的顯著因素.

2.6 裝液量的影響

溶解氧是好氧微生物生長的重要生長條件，從而溶解氧質(zhì)量濃度也會影響微生物對苯酚的利用效率.試驗(yàn)中采用改變裝液量的方式改變搖瓶內(nèi)的溶解氧含量，以實(shí)現(xiàn)不同溶解氧質(zhì)量濃度的目的.圖7給出了不同裝液量情況下，菌株在24 h內(nèi)的降酚情況.從圖7中可以看出，使用250mL的三角瓶，隨著裝液量的增加，溶液的溶解氧降低，相應(yīng)的苯酚降解率也逐漸降低.當(dāng)裝液量＞100mL，通氣量明顯不足，菌體生長較差，苯酚降解率顯著下降;而100mL以下的裝液量對降酚率影響不大.后續(xù)試驗(yàn)中，采用100mL為最適裝液量.

2.7 外加碳源的影響

因高質(zhì)量濃度苯酚對微生物的毒害作用，導(dǎo)致微生物生長量下降，不利于生物降解，此時(shí)投加適量易降解基質(zhì)可促進(jìn)微生物量的增殖，有利于難降解化合物的生物降解［22］.本項(xiàng)研究中，通過添加葡萄糖考察了外加碳源對菌株利用苯酚的影響.綜合圖8、9可以看出，雖然葡萄糖的加入使菌濁迅速增長，但對起始階段的苯酚降解并沒有促進(jìn)作用.無添加葡萄糖的一組在12 h對苯酚已有20%左右的降解，而添加葡萄糖的試驗(yàn)組反而對苯酚幾乎無降解，這是由于菌株獲得了更容易利用的基質(zhì)，因而停止了對苯酚的利用.12 h后，添加少量葡萄糖(0.5 g/L和1.0 g/L)試驗(yàn)組的苯酚降解速率明顯加快，這是因?yàn)槠咸烟堑耐度胙杆偬岣吡藢?shí)驗(yàn)組的微生物量，而在葡萄糖被完全利用后，菌株開始轉(zhuǎn)而利用苯酚為營養(yǎng)基質(zhì)，從而使得苯酚利用率迅速提高.在添加質(zhì)量濃度≥1.5 g/L的試樣中，菌株在試驗(yàn)周期內(nèi)始終處于富營養(yǎng)階段，加入的葡萄糖足以滿足其全部營養(yǎng)需求，由此降低了其對于苯酚的利用，造成苯酚利用“受抑制”的假象.為提高苯酚降解率，后續(xù)試驗(yàn)中投加的葡萄糖質(zhì)量濃度應(yīng)控制在0.0 ～1.0 g/L.

3 討論與結(jié)論

1)采用苯酚選擇性培養(yǎng)基從實(shí)驗(yàn)室前期培養(yǎng)的苯酚降解顆粒污泥中富集分離出了18株苯酚降解菌株，其中挑選出具有高苯酚耐受和降解率的1#菌株，其可耐受苯酚質(zhì)量濃度達(dá)2000mg/L，24 h內(nèi)可使初始質(zhì)量濃度為1000mg/L的苯酚降解達(dá)到95%以上，經(jīng)鑒定為熱帶假絲酵母(C.tropicalis).

2)對該菌株降解苯酚的試驗(yàn)表明，其最佳投加量為3%，最適溫度為30～35℃，pH值為6～8，裝瓶量為100mL/250mL，初始苯酚質(zhì)量濃度為1000mg/L.

3)為促進(jìn)菌株的快速增殖并提高其降酚效率，外加碳源葡萄糖的投加質(zhì)量濃度應(yīng)控制在0.0～1.0 g/L，過低則不利于微生物增殖，過高則不利于菌株對苯酚的有效利用.

［1］金相燦，程振華，徐南妮，等.有機(jī)化合物污染化學(xué)［M］.北京:清華大學(xué)出版社，1999:250－265.

［2］黃蓓佳，張?zhí)m英，王少平.低溫條件下1，2，4－三氯苯降解菌的篩選及降解特性［J］.環(huán)境科學(xué)研究，2008，21(5):19－22.

［3］HA S R，VINTTNANTHARAT S，OZAKI H.Bioregeneration by mixed microorganisms of granular activated carbon loaded with a mixture of phenols［J］.Biotechnology Letters，2000，22(13):1093－1096.

［4］SANTOS V L，LINARDI V R.Biodegradation of phenol by a filamentous fungi isolated from industrial effluents－identification and degradation potential［J］.Process Biochemistry，2004，39(8):1001－1006.

［5］汪晉三，黃新華，程國佩.水化學(xué)與水污染［M］.廣州:中山大學(xué)出版社，1990:367－370.

［6］WAGNER M，NICELL J A.Peroxidase－catalyzed removal of phenols from a petroleum refinery wastewater［J］.Water Science Technology，2001，43(2):253－260.

［7］佟麗萍，唐 霞，朱寶花，等.含酚廢水處理方法的選擇［J］.工業(yè)水處理，1998，18(5):36－37.

［8］邱凌峰，吳芳芳，姚 堯.苯酚降解菌TX1的分離鑒定及其降解特性［J］.上海環(huán)境科學(xué)，2010，29(1):35－40.

［9］JEONG J J，KIM J H，KIM C K，et al.3－ and 4－alkylphenol degradation pathway in Pseudomonas sp.strain KL28:genetic organization of the lap gene cluster and substrate specificities of phenol hydroxylase and catechol 2，3－dioxygenase［J］.Microbiology，2003，149(11):3265－3277.

［10］TERAMOTO M，OHNISHI K，HARAYAMA S，et al.An AraC/XylS family member at a high level in a hierarchy of regulators for phenol－metabolizing enzymes in Comamonas testosteroni R5［J］.Journal of Bacteriology，2002，184(14):3941－3946.

［11］TSIROGIANNI I，AIVALIOTIS M，KARAS M，et al.Mass spectrometric mapping of the enzymes involved in the phenol degradation of an indigenous soil pseudomonad［J］.Biochimica et Biophysica acta，2004，1700(1):117－123.

［12］MANGRULKAR P A，KAMBLE S P，MESHRAM J，et al.Adsorption of phenol and o－chlorophenol by mesoporous MCM－41［J］.Journal of hazardous materials，2008，160(2－3):414－421.

［13］錢存柔，黃儀秀.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程［M］.北京:北京大學(xué)出版社，1999:225－228.

［14］國家環(huán)保局《水和廢水監(jiān)測分析方法》編委會.水和廢水監(jiān)測分析方法［M］.北京:中國環(huán)境科學(xué)出版社，1997:408－410.

［15］許慶清，周作明.微生物降解苯酚廢水的特性研究［J］.環(huán)境科學(xué)與管理，2006，31(4):136－138.

［16］SA C S A，BOAVENTURA R A R.Biodegradation of phenol by Pseudomonas putida DSM 548 in a trickling bed reactor［J］.Biochemical Engineering Journal，2001，9(3):211－219.

［17］LALLAI A，MURA G.Kinetics of growth for mixed cultures of microorganisms growing on phenol［J］.The Chemical Engineering Journal，1989，41(3):55－60.

［18］CHUNG T P，TSENG H Y，JUANG R S.Mass transfer effect and intermediate detection for phenol degradation in immobilized Pseudomonas putida systems［J］.Process Biochemistry，2003，38(10):1497－1507.

［19］UCUN H，YILDIZ E，NUHOGLU A.Phenol biodegradation in a batch jet loop bioreactor(JLB):Kinetics study and pH variation［J］.Bioresource Technology，2010，101(9):2965－2971.

［20］MONTEIRO A M G，BOAVENTURA R A R，RODRIGUES A E.Phenol biodegradation by Pseudomonas putida DSM 548 in a batch reactor［J］.Biochemical Engineering Journal，2000，6(1):45－49.

［21］ONYSKO K A，BUDMAN H M，ROBINSON C W.Effect of temperature on the inhibition kinetics of phenol biodegradation by pseudomonas putida Q5［J］.Biotechnology and Bioengineering，2000，70(3):291－299.

［22］HABY P A，CROWLEY D E.Biodegradation of 3－chlorobenzoate as affected by rhizodeposition and selected carbon substrates［J］.Journal Environment Quality，1996，25(2):304－310.