王軍民 劉石萍 方澍名 姚希賢

肝纖維化(LF)是所有慢性肝病進展成肝硬化的必經(jīng)階段，而肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)則是肝星狀細胞(HSCs)的活化與增殖，因此抑制HSCs活化與增殖則成為阻止并逆轉(zhuǎn)肝纖維化的主要途徑之一。經(jīng)大量臨床與基礎(chǔ)研究證實，中藥有效方劑“益肝康”對肝纖維化有相當?shù)闹委熥饔茫?］。目前尚乏慢性乙型肝炎患者“益肝康”藥物血清對HSCs細胞內(nèi)Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制影響的研究。本實驗采用激光共聚焦顯微鏡(LSCM)與第三代鈣熒光探針Fluo-3/AM技術(shù)，觀察經(jīng)用慢性乙型肝炎患者制備的“益肝康”藥物血清對血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)介導(dǎo)的HSCs胞漿游離鈣(Ca2+i)變化的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 病例選擇:河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院消化內(nèi)科門診就診及病房住院之慢性乙型肝炎患者。

1.2 納入標準 (1)符合5中華醫(yī)學(xué)會傳染病與寄生蟲病學(xué)分會肝病學(xué)分會、病毒性肝炎防治方案6慢性乙型肝炎診斷標準;(2)年齡18～55歲，性別男性;(3)HBVDNA(+)的“小三陽”患者;(4)肝纖維化血清標志物肝纖四項(HA、LN、PⅢP、IV-7s)有陽性表現(xiàn);(5)影像學(xué)檢查脾臟脾門處厚度4～4.5 cm，門靜脈主干及脾門靜脈內(nèi)徑正常;(6)研究期間同意不服用免疫調(diào)節(jié)劑、退黃藥物及其他中藥。

1.3 排除標準 (1)合并其他類型肝炎者;(2)嚴重心、腎疾患者;(3)膽紅素＞5ULN;(4)近期(6個月)應(yīng)用免疫抑制或增強劑者;(5)肝硬化失代償期患者。

1.4 細胞株 肝星狀細胞株CFSC由美國Greenwel教授建株并惠贈，其表型為活化的HSCs，從四氯化碳(CCl4)誘發(fā)的肝硬化大鼠中分離并通過培養(yǎng)使細胞自發(fā)獲得永生性［4］，冷凍保存于液氮中。

1.5 液體配制

1.5.1 正常含鈣細胞培養(yǎng)液/臺氏液:NaCl 130 mmol/L，KCl 2.7 mmol/L，CaCl21.5 mmol/L，MgCl22 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，glucose 10 mmol/L，pH 值7.4(NaOH)。

1.5.2 青霉素、鏈霉素雙抗溶液:使用濃度青霉素為100 U/ml，鏈霉素 100 μg/ml，配成 100 倍貯存液，－20℃ 貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 方法

1.6.1 藥物血清的提取及細胞培養(yǎng):采用改良血清藥理學(xué)方法，即采用慢性乙型肝炎患者進行藥物實驗，再提取藥物血清進行體外細胞培養(yǎng)，使體外實驗盡量準確再現(xiàn)在體藥物與機體相互作用過程。

1.6.2 患者血清分組:A組:服用“益肝康”前;B組:服用“益肝康”后。

1.6.3 藥物血清的制備:征求患者同意，簽定同意書，15名觀察對象服藥前采靜脈血5 ml，然后給予“益肝康”150 ml(1袋)，2次/d，療程7 d時作為觀察終點。服用“益肝康”前后，均于晨起外周靜脈取血，常溫靜置3 h，4℃離心，3000 r/min，20 min，分離血清，其中有溶血者棄之不用。同組血清合并混勻，56℃ ×30 min水浴滅活，用0.22 μm 濾器過濾除菌，－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.4 細胞培養(yǎng) 將冷凍保存于液氮中的HSCs復(fù)蘇后接種于含10% 胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素、4 mmol/L L-谷氨酰胺及1 mol/LHEPES的10%RPMI-1640培養(yǎng)液(pH值7.4)中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。當細胞呈單層致密狀時，用0.25%胰蛋白酶消化后以1∶3傳代，24 h換液，72 h再次傳代。

1.6.5 實驗分組:每次實驗均在呈指數(shù)生長的細胞中進行，將2 cm×2 cm蓋玻片預(yù)先放置在6孔培養(yǎng)板，細胞消化后以1.0×104/ml的密度接種2 ml制備爬片，培養(yǎng)箱中孵育至細胞80%融合時，棄培養(yǎng)液，換不含胎牛血清的細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細胞基本同步化于G0期后進行實驗。實驗細胞分組如下(n=8):A組為服用“益肝康”前血清干預(yù)組;B組為服用“益肝康”后藥物血清干預(yù)組

1.6.6 藥物血清預(yù)處理:將上述爬片細胞分為2組，每孔加入10%RPMI-1640培養(yǎng)液900 μl，然后各實驗孔采用盲法分別給予A組藥物血清或B組血清100 μl，終濃度為10%。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進行實驗。

1.7 檢測胞漿游離鈣 采用盲法，用10%藥物血清培養(yǎng)HSCs24 h，再將經(jīng)藥物血清預(yù)處理的HSCs及對照組細胞負載Fluo-3/AM后使用激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)檢測Ca2+i。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HSCs的Ca2+熒光成像 LSCM下Ca2+成像的HSCs仍可見普通倒置顯微鏡下的形態(tài)特征，細胞Ca2+i的濃度的高低由細胞被激發(fā)出的熒光強弱表示，熒光強度越強，表示Ca2+i濃度越高，反之則越低。本實驗HSCs與Fluo-3/AM孵育后，所有細胞均被染色，且每組各細胞間的強度基本一致。

2.2 靜息狀態(tài)下HSCsCa2+i的動態(tài)變化 為證明細胞培養(yǎng)液本身對HSCsCa2+i的影響，本研究觀察了6個HSCs在實驗所需的時間內(nèi)(5 min)Ca2+i的動態(tài)變化，結(jié)果表明，HSCs在實驗所需的整個時間內(nèi)Ca2+i熒光強度基本保持穩(wěn)定。

2.3 不同濃度Ang-Ⅱ?qū)SCs的累積反應(yīng)曲線 加入濃度梯度Ang-Ⅱ后，HSCs熒光強度逐漸增加，作出累積反應(yīng)曲線后，得到EC50值約為1.1×10-7mol/L。

2.4 “益肝康”藥物血清對HSCsCa2+i的影響 經(jīng)“益肝康”藥物血清預(yù)處理HSCs后均可明顯減低細胞Ca2+i，熒光強度相對值(FI)與經(jīng)服藥前患者血清預(yù)處理HSCs組結(jié)果相比，Ca2+i下降達52.37%，兩者相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)。見表 1、圖 1。

2.5 “益肝康”藥物血清對Ang-Ⅱ介導(dǎo)的HSCsCa2+i變化的影響 給予 Ang-Ⅱ(1.1×10－7mol/L)刺激 HSCs，經(jīng)“益肝康”藥物血清預(yù)處理的HSCs，細胞Ca2+i熒光強度變化百分數(shù)(CRF)明顯減低，同經(jīng)服藥前患者血清預(yù)處理HSCs組結(jié)果相比，下降達90.50%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)。見表1、圖2。

3 討論

圖1 “益肝康”藥物血清對HSCs胞漿游離鈣熒光強度相對值的影響

圖2 “益肝康”藥物血清漿游高鈣熒光強度變化百分數(shù)的影響

表1 “益肝康”藥物血清對胞漿游離鈣熒光強度相對值及變化百分數(shù)的影響n=8，

表1 “益肝康”藥物血清對胞漿游離鈣熒光強度相對值及變化百分數(shù)的影響n=8，

注:與A組比較，*P ＜0.01

組別FI CRF A組53 ±15 1.000 ±0.370 B 組 25 ±7* 0.095 ±0.028*

目前研究認為，生物信號跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)的基本途徑包括cAMP、cGMP、三磷酸肌醇(IP3)和Ca2+等系統(tǒng)。其中作為“信使之王”的Ca2+尤為重要，而其在細胞內(nèi)濃度的增加是細胞增殖分裂不可缺少的條件。在HSCs活化過程中，其胞漿內(nèi)Ca2+的是諸多生長因子、細胞因子及氧化應(yīng)激產(chǎn)物等發(fā)揮促生長和增殖作用的主要介質(zhì)之一。最近的許多實驗證實，HSCs上存在著L型-電壓依賴性鈣通道(L型-VOCC)，Oide等［2］發(fā)現(xiàn) HSCs尚含有T型電壓依賴性鈣通道(T型-VOCC)，且可被TGF-1激活。細胞外Ca2+可通過被激活的Ca2+通道流入細胞內(nèi)，加之胞內(nèi)鈣庫受損使Ca2+大量釋放，引起Ca2+i持續(xù)性升高，細胞內(nèi)外Ca2+i梯度降低，細胞去極化，興奮性增加，從而激活HSCs，使其增殖并大量表達膠原蛋白，加速肝纖維化的形成。郭傳勇等［3］觀察內(nèi)皮素-1對培養(yǎng)鼠肝星狀細胞的影響，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮素-1在促進HSCs增殖及膠原合成的同時，細胞內(nèi)游離鈣的水平也顯著升高，且Ca2+i濃度升高呈雙相反應(yīng)，一是快速短暫的瞬時峰值升高相(Ⅰ相);二是緩慢持久升高相 (Ⅱ相)。而且上述作用呈劑量依賴關(guān)系。推測Ⅱ相升高起主要作用，可進一步激活c-fos、c-myc等癌基因表達，籍此調(diào)節(jié)HSCs細胞分裂和增殖的功能，并使HSCs分泌ECM能力增強。鐘敏章等［4］在實驗中發(fā)現(xiàn)，用漢防己堿及維拉帕米治療可使HSCs數(shù)目減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)面積減少，線粒體、高爾基體產(chǎn)生與分泌膠原的細胞器均受到抑制，說明鈣通道阻斷劑抗肝纖維化作用部分與其抑制HSCs增殖及其向肌成纖維樣細胞轉(zhuǎn)化有關(guān)，也暗示Ca2+i在HSCs活化與增殖中起著重要作用。

有研究表明，丹參及其提取物可抑制心肌細胞及內(nèi)皮細胞應(yīng)激所致鈣超載［5］，本實驗結(jié)果表明，經(jīng)慢性乙型肝炎患者提取的“益肝康”藥物血清預(yù)處理HSCs，與服藥前提取的患者血清預(yù)處理HSCs相比，前者鈣熒光強度明顯低于后者(P＜0.01)，顯示“益肝康”藥物血清顯著抑制了HSCs細胞內(nèi)鈣的升高。其機制可能是經(jīng)含藥血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，藥物發(fā)揮了其抑制HSCs鈣動員的作用，推測該作用可能與“益肝康”的主藥-丹參阻斷了HSCs細胞膜上的L型-VOCC從而減少了鈣離子的內(nèi)流有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，在受到不同濃度的AngⅡ刺激時，HSCs-Ca2+i與AngⅡ成量效關(guān)系。提示AngⅡ可以通過提高Ca2+i而在HSCs的增殖中發(fā)揮重要作用。本實驗結(jié)果尚表明，給予Ang-Ⅱ刺激后，“益肝康”藥物血清預(yù)處理的HSCs，其Ca2+i熒光強度變化百分數(shù)明顯低于服藥前血清預(yù)處理的HSCs(P＜0.001)，提示“益肝康”阻斷或抑制了HSCs的Ang-Ⅱ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，該通路可能是 Ang-Ⅱ激活的受體依賴性鈣通道(ROCC)，從而抑制了其致HSCs內(nèi)鈣升高的作用，并因此抑制HSCs活化與增殖。此機制可能與“益肝康”的主要組分——丹參下調(diào)AT-1受體水平密切相關(guān)。

1 房澍名，姚冬梅，王軍民，等.益肝康及其拆方對肝星狀細胞活化增殖及膠原代謝影響的研究.河北醫(yī)藥，2008，30:1481-1482.

2 Oide H，Itatsu T，Hirose M，et al.Acute and chronic effect of alcohol on Ca2+channels in hepatic stellate cells.Alcohol Clin Exp Res，2000，24:357-360.

3 郭傳勇，鄔贊斌，伍建業(yè)，等.內(nèi)皮素-1對培養(yǎng)鼠肝星狀細胞內(nèi)游離鈣的影響.中國病理生理雜志，2004，20:2118-2119.

4 鐘敏章，郭傳勇，王炳芳，等.內(nèi)皮素-1對肝星狀細胞增殖及膠原合成與分泌的調(diào)控作用.同濟大學(xué)學(xué)報，2002，23:273-275.

5 李金鳳，王孝銘，徐長慶，等.利用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察丹參滴丸對乳鼠心肌細胞缺氧的保護作用.中國病理生理雜志，2000，16:1026.