郭偉男 孫立敏 張鍾元 馬翠卿 李曉 胡建秀 范秀華

子宮內(nèi)膜息肉的發(fā)生與其局部雌孕激素(E2、P)水平及其受體［雌激素受體(ER)，孕激素受體(PR)］表達(dá)有關(guān)，局部?jī)?nèi)膜組織接受甾體信號(hào)，并刺激相關(guān)蛋白表達(dá)，造成本病的發(fā)生與發(fā)展，甚至有學(xué)者認(rèn)為子宮內(nèi)膜息肉與子宮內(nèi)膜癌有必然聯(lián)系［1］。通過(guò)研究圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后子宮內(nèi)膜息肉患者局部雌孕激素受體的含量并與正常內(nèi)膜進(jìn)行比較，揭示甾體激素因素在圍絕經(jīng)期、絕經(jīng)后女性子宮內(nèi)膜息肉發(fā)生中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2009年1月至2010年6月就診于河北省正定縣人民醫(yī)院和河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院門診宮腔鏡室經(jīng)子宮內(nèi)膜息肉切除術(shù)(TCRP)，或因子宮肌瘤合并子宮內(nèi)膜息肉而行子宮切除的圍絕經(jīng)期(圍絕經(jīng)期組，11例)及絕經(jīng)后(絕經(jīng)組，8例)子宮內(nèi)膜息肉患者共19例，選取同期因生殖道脫垂而行子宮切除，排除子宮內(nèi)膜病變患者9例(對(duì)照組)，年齡42～60歲，體重具有可比性，排除雌激素替代及肝腎疾患，無(wú)婦科惡性腫瘤病史。

1.2 方法

1.2.1 資料采集:組織取下后分成2份，一部分4%多聚甲醛固定，用于HE染色及免疫組化SP法檢測(cè)組織中ER和PR表達(dá);另一部分置于EP管中液氮保存，用于逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)半定量檢測(cè)ER和PR轉(zhuǎn)錄水平。

1.2.2 SP法免疫組化檢測(cè)ER、PR表達(dá):采用免疫組化SP法檢測(cè)各組中ER、PR蛋白的表達(dá)。陰性對(duì)照一抗以 PBS替代，陽(yáng)性對(duì)照由試劑公司提供的乳腺癌標(biāo)本。ERα兔抗人多克隆抗體、ERβ兔抗人多克隆抗體均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;二抗、DAB顯色劑等均購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司。采用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)，對(duì)于每張樣片隨機(jī)取5個(gè)部位進(jìn)行圖像采集。

1.2.3 RT-PCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)錄水平

1.2.3.1 引物:ER 引物:上游5’-GGAGACATGAGAGCTGCCA-3’，下游 5’-CCAGCAGCATGTCGAAGATC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小:438 bp;PR引物:上游 5’-TCATGAGCCGGTCCGGGTGCAAG-3’，下游 5’-CGGGGTGGACGAGGCACAGG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小:196 bp;β-actin引物:Actb-F:5’-TACCCAGGCATTGCTGACAGG-3’，Actb-R:5’-ACTTGCGGT GCACGATGGA-3’，目的片段長(zhǎng)度205 bp。

1.2.3.2 PCR 擴(kuò)增:擴(kuò)增體系包括:上下游引物:2.5 μl、逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(cDNA):1 μl、dNTP(2 mmol/L):1 μl、Buffer:2 μl、ddH2O:14.85 μl，共 25 μl。ER 擴(kuò)增條件:95℃ 預(yù)變性 5 min，95℃變性 30 s、53℃退火 30 s、72℃ 30 s，72℃ 延伸5 min，30 個(gè)循環(huán)，4℃保存;PR擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5 min，進(jìn)入循環(huán)，95℃變性 45 s、55℃退火 30 s、72℃延伸 30 s，30 個(gè)循環(huán)后 72℃最后延伸5 min，4℃保存。

1.2.3.3 產(chǎn)物分析:紫外透射儀上觀察結(jié)果并照相，選用Band Scan 5.0凝膠圖像處理軟件進(jìn)行光密度值分析，采用目的基因與β-actin光密度的比值表示目的基因的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化比較 見(jiàn)表1。

表1 3組免疫組化比較

表1 3組免疫組化比較

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05

ER PR對(duì)照組(n=9)組別0.578±0.146 0.521±0.143圍絕經(jīng)期組(n=11) 0.779±0.311* 0.692±0.214絕經(jīng)后組(n=8) 0.904±0.432* 0.847±0.384*

2.2 RT-PCR比較 見(jiàn)表2。

表2 2組RT-PCR比較

表2 2組RT-PCR比較

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05;與圍絕經(jīng)期組比較，#P＜0.05

ER PR對(duì)照組(n=9)組別0.734±0.302 0.421±0.107圍絕經(jīng)期組(n=11) 1.253±0.305* 0.768±0.201*絕經(jīng)后組(n=8) 1.004±0.238* 0.832±0.424*#

2.3 免疫組化及RT-PCR圖 圍絕經(jīng)息肉中ER表達(dá)上調(diào)，而圍絕經(jīng)息肉中ER、PR的表達(dá)均上調(diào)。圍絕經(jīng)期息肉中及絕經(jīng)后息肉中的ER、PR的RNA轉(zhuǎn)錄水平較正常組都有所提高，同時(shí)絕經(jīng)后息肉組較圍絕經(jīng)期組中的PR的RNA轉(zhuǎn)錄水平有所提高。見(jiàn)圖1、2。

圖1 3組免疫組化檢測(cè)ER、PR蛋白表達(dá)(IHC×40)

圖2 3組RT-PCR檢測(cè)ER、PR轉(zhuǎn)錄水平

3 討論

E2通過(guò)與ER結(jié)合，形成二聚體，再通過(guò)與靶基因中的雌激素反應(yīng)元件(ERE)特異性結(jié)合，形成細(xì)胞信號(hào)刺激靶基因轉(zhuǎn)錄［2］，造成一系列促進(jìn)靶器官細(xì)胞增殖和分化的蛋白表達(dá)，對(duì)子宮內(nèi)膜作用即表現(xiàn)為促進(jìn)子宮內(nèi)膜的增生和血管增殖。此外E2通過(guò)正反饋?zhàn)饔眠€可在DNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄水平上誘導(dǎo)ER和PR生成，長(zhǎng)期過(guò)度的作用即可使子宮內(nèi)膜發(fā)生增生甚至癌變，而增生的一個(gè)表現(xiàn)即為形成子宮內(nèi)膜息肉。在對(duì)孕齡女性的研究中發(fā)現(xiàn)，并非ER都參與了子宮內(nèi)膜息肉的形成，E2及ER在其中起著更為重要的作用［3］，而PR在息肉中的表達(dá)降低，可能提示P及PR途徑對(duì)本病發(fā)生起保護(hù)作用。

增殖期息肉中PR處于低水平、相對(duì)缺乏的狀態(tài)，使其進(jìn)入分泌期后對(duì)P的反應(yīng)能力下降，從而使P抑制ER產(chǎn)生的作用減弱，導(dǎo)致ER持續(xù)高水平表達(dá)，細(xì)胞增殖形成息肉［4，5］。我們研究發(fā)現(xiàn)，圍絕經(jīng)期子宮內(nèi)膜息肉患者局部ER表達(dá)升高，無(wú)論從蛋白水平還是從轉(zhuǎn)錄水平均得到證實(shí)，與肖艷景等［6］研究結(jié)果相一致，與孕齡女性子宮內(nèi)膜息肉發(fā)病機(jī)制相一致［7］，而在絕經(jīng)后子宮內(nèi)膜息肉的研究中發(fā)現(xiàn)，局部雌孕激素受體表達(dá)均升高，這在轉(zhuǎn)錄水平的研究更為明顯(P＜0.05)，這與孕齡女性子宮內(nèi)膜息肉中的表達(dá)相悖［8］，與傳統(tǒng)E2、P及其受體途徑作用觀點(diǎn)相反(E2與ER結(jié)合，產(chǎn)生促進(jìn)細(xì)胞增殖相關(guān)信號(hào)，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜呈增生期改變，P與PR結(jié)合后產(chǎn)生一系列相關(guān)信號(hào)促進(jìn)細(xì)胞成熟，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜向分泌期轉(zhuǎn)化)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:絕經(jīng)后子宮內(nèi)膜息肉的發(fā)病機(jī)制與圍絕經(jīng)期及孕齡女性不同，因此在治療絕經(jīng)后子宮內(nèi)膜息肉的方法選擇上，建議絕經(jīng)后女性避免使用E2、P替代治療。

隨著對(duì)激素路徑的不斷研究，發(fā)現(xiàn)ER、PR均存在亞型，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn):ERα是造成子宮內(nèi)膜癌的重要原因，而ER β則對(duì)子宮內(nèi)膜惡變起保護(hù)作用［9］。近年來(lái)有越來(lái)越多學(xué)者著手于P亞型的研究，發(fā)現(xiàn)不同P亞型可能作用不同［10］，在絕經(jīng)后子宮內(nèi)膜息肉的發(fā)病中是否由于不同孕激素亞型造成，還有待進(jìn)一步研究。

1 張瑩，劉潔，崔月梅.宮腔鏡電切術(shù)診治子宮內(nèi)膜息肉的臨床應(yīng)用.河北醫(yī)藥，2010，32:2516-2517.

2 Jeffers WN，Couse JF，Banks EP，et al.Expression of estrogen receptor beta is developmentally regulated in reproductive tissues of male and female mice.Biol Reprod，2000，62:310-317.

3 Suzuki T，Shimizu T，Yu HP，et al.Salutary effects of 17beta-estradiol on T-cell signaling and cytokine production after trauma-hemorrhage are mediated primarily via estrogen receptor-alpha.Physiol Cell Physiol，2007，292:2103-2113.

4 Taylor LJ，Jackson TL，Reid JG，et al.The differential expression of oestrogen receptors，progesterone receptors，bcl-2 and ki-67 in endometrial polyps.Obstet Gynaecol，2003，110:794-798.

5 Bakout SH，Gupta JK，Khan KS.Risk factors associated with endometrial polyps in abnormal uterine bleeding.Menopause，2003，10:534-537.

6 肖艷景，張全武，謝林森，等.ER與PR等在絕經(jīng)后子宮內(nèi)膜息肉中的表達(dá).實(shí)用技師雜志，2006，13:1659-1661.

7 范秀華，邢小芬，劉淳，等.ER、PR、HSP70和HSP90在子宮內(nèi)膜息肉治療前后的表達(dá)及意義.河北醫(yī)藥，2009，31:3343-3345.

8 羅雪梅，程秋蓉，孟曉軍，等.子宮內(nèi)膜息肉發(fā)病的相關(guān)因素研究.中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2010，13:588-590.

9 王海霞，解其貴，趙俊紅，等.子宮內(nèi)膜癌雌激素受體α、β亞型和孕激素受體mRNA表達(dá)與臨床病理的關(guān)系.中國(guó)臨床醫(yī)學(xué)，2008，15:863-865.

10 陳銳，于麗，廖秦.子宮內(nèi)膜癌中孕激素受體亞型表達(dá)及其甲基化狀態(tài)的研究.現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展，2008，7:501-505.