王海賓 國(guó)文 楊淑嶺 康書(shū)慧 劉海云 曹金鳳 田紅衛(wèi) 檀新云 劉玉肖

結(jié)核病是嚴(yán)重危害人類健康的重要傳染病之一。早在一百多年前Robert Koch就發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌是結(jié)核病的致病菌。由于缺乏完善的診斷技術(shù)，結(jié)核仍然是威脅人類健康傳染病中的“頭號(hào)殺手”［1］。事實(shí)上，在感染人群中，90% ～95%的感染者處于休眠狀態(tài)，僅有5%～10%最終進(jìn)展為臨床結(jié)核?。?］。目前國(guó)外已有不少研究探討IFN-γ基因多態(tài)性與某些傳染病(如結(jié)核病、乙型肝炎、利什曼原蟲(chóng)等)間的關(guān)聯(lián)［3－5］，但對(duì)于該多態(tài)性位點(diǎn)與中國(guó)漢族人群結(jié)核發(fā)生間的關(guān)聯(lián)研究并不多見(jiàn)。因此，我們采用擴(kuò)增難控制突變系統(tǒng)PCR(ARMSPCR)方法分析273例肺結(jié)核患者、297例對(duì)照明人群IFN-γ +874位點(diǎn)基因多態(tài)性與肺結(jié)核發(fā)病間的關(guān)聯(lián)，并探討可能的基因-環(huán)境交互作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 病例組入選與排除標(biāo)準(zhǔn):選擇2008年3月至2009年3月石家莊市第五醫(yī)院結(jié)核科選擇肺結(jié)核新發(fā)病例，所有病例均按以下國(guó)家統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)確診，即痰菌陽(yáng)性同時(shí)胸X線片有肺結(jié)核特征病灶;或痰菌陰性，但胸部X線片示活動(dòng)性肺結(jié)核征象、結(jié)核菌純蛋白衍化物(purified protein derivative，PPD)試驗(yàn)強(qiáng)陽(yáng)性并具有明顯結(jié)核病臨床體征者。

1.1.2 對(duì)照組入選與排除標(biāo)準(zhǔn):選擇同醫(yī)院中無(wú)結(jié)核病史、診斷為其他疾病的患者，或病例的健康同事、親友，對(duì)所有對(duì)照經(jīng)X線胸透，排除近期結(jié)核感染者，同時(shí)排除其他部位結(jié)核、肺炎、肺癌、塵肺等結(jié)核相似病癥，HIV感染、慢性疾病、腫瘤患者、長(zhǎng)期使用激素或器官移植等免疫功能低下者。

1.2 問(wèn)卷內(nèi)容 設(shè)計(jì)統(tǒng)一的調(diào)查問(wèn)卷，由調(diào)查組成員對(duì)所有研究對(duì)象進(jìn)行面對(duì)面的問(wèn)卷調(diào)查，內(nèi)容包括基本特征(如年齡、性別、籍貫、婚姻狀況、文化程度、居住地、經(jīng)濟(jì)收入等)、生活行為方式(吸煙、飲酒、肉類攝入、居住環(huán)境、健身活動(dòng)等)。既往病史、家族史、結(jié)核相關(guān)因素接觸史、卡介苗接種史(以研究對(duì)象上臂的卡痕來(lái)判斷，由專業(yè)臨床醫(yī)生檢查卡痕并記錄)。利用問(wèn)卷培訓(xùn)流調(diào)人員，對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行預(yù)調(diào)查后進(jìn)行相關(guān)的修訂和改進(jìn)。

1.3 基因多態(tài)性檢測(cè)

1.3.1 基因組DNA提取:每個(gè)研究對(duì)象抽取3 ml血液，EDTA抗凝，全血基因組快速提取試劑盒(天根公司)提取全血中基因組DNA。

1.3.2 基因多態(tài)性分析

1.3.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成參:參照文獻(xiàn)［6］設(shè)計(jì)擴(kuò)增 IFN-γ 基因第一內(nèi)含子+874位點(diǎn)的PCR引物，由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成。其中通用反向引物與特異正向引物1構(gòu)成第一對(duì)，用于擴(kuò)增于IFN-γ+874A，產(chǎn)物片段為261 bp，通用反向引物與特異正向引物2構(gòu)成第二對(duì)，用于擴(kuò)增IFN-γ+874T，產(chǎn)物片段為261 bp，內(nèi)參照正向引物與反向引物構(gòu)成第三對(duì)，用于判定PCR體系的成功與否，產(chǎn)物片段為426 bp。每個(gè)樣本均進(jìn)行兩次PCR反應(yīng)，如果僅有第一對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物合并內(nèi)參照產(chǎn)物為陽(yáng)性，結(jié)果判定為+874AA基因型，如果僅第二對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物合并內(nèi)參照產(chǎn)物為陽(yáng)性，結(jié)果判定為+874TT基因型，如果兩對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物合并內(nèi)參照產(chǎn)物均為陽(yáng)性，則結(jié)果判定為+874A/T基因型。見(jiàn)表1。

1.3.2.2 PCR 反應(yīng)條件:10 × PCR 緩沖液 3 μl，2.5 mmol/LdNTP Mixture 3 μl，Taq DNA 聚合酶1.5 U，10 μmol/L 的通用反向引物和特異性正向引物各1 μl，10 μmol/L的內(nèi)對(duì)照上、下游引物引物各 0.5 μl，DNA 模板 1 μl，補(bǔ)水至總體積 30 μl。PCR反應(yīng)條件為95℃熱啟動(dòng)1 min，進(jìn)入第一部分循環(huán)，95℃、15 s，62℃、50 s，72℃、40 s，10 個(gè)循環(huán)，然后進(jìn)入第二部分循環(huán)，95℃、20 s，56℃、50 s，72℃、50 s，20 個(gè)循環(huán)，最后于 72℃ 延伸10 min。

表1 應(yīng)用ARMS-PCR檢測(cè)IFN-g基因多態(tài)性

1.3.2.3 擴(kuò)增產(chǎn)物的分析:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用含有EB的2%瓊脂糖凝膠，1×TAE緩沖液，99V恒壓電泳30 min，紫外燈下觀察結(jié)果，并用法國(guó)VL自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行成像和分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，用基因計(jì)數(shù)法計(jì)算各組IFN-γ+874啟動(dòng)子基因型頻率和等位基因頻率，Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗(yàn)群體代表性。單因素分析估計(jì)基因型與疾病的關(guān)聯(lián)，計(jì)算OR值及其95%CI。然后，將是否發(fā)病作因變量，各基因型作為自變量，前述有顯著意義的環(huán)境相進(jìn)行多因素非條件logistic回歸分析，最大似然比法估計(jì)調(diào)整OR值及其95%CI。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組環(huán)境相關(guān)的單因素分析 年齡、籍貫、婚姻狀況、文化程度、居住地、經(jīng)濟(jì)收入等因素在2組中的分布無(wú)差異。對(duì)環(huán)境相關(guān)的單因素分析，結(jié)核患者密切接觸史及卡介苗接種史兩個(gè)因素在病例組和對(duì)照組中分布有差異，前者是肺結(jié)核發(fā)生的危險(xiǎn)因素，而后者則是疾病發(fā)生的保護(hù)因素。而健身狀況、吸煙、飲酒等其他因素在2組中分布無(wú)差異。

2.2 IFN-γ基因多態(tài)性位點(diǎn)與肺結(jié)核易感性的單因素分析用基因計(jì)數(shù)法計(jì)算2組人群IFN-γ+874基因型頻率，經(jīng)Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗(yàn)(P ＞0.05)，符合 Hardy-Weiberg遺傳平衡。在本研究人群中，IFN-γ基因+874AA、AT和TT基因型在病例組中的分布頻率分別為70.33%、28.57%和1.10%，在對(duì)照組中的分布頻率分別為70.71%、28.28%和1.01%。見(jiàn)表2。

表2 IFN-γ基因多態(tài)性位點(diǎn)與肺結(jié)核易感性的單因素分析例(%)

2.3 IFN-γ基因多態(tài)性位點(diǎn)與肺結(jié)核易感性的多因素分析IFN-γ基因+874位點(diǎn)基因多態(tài)性見(jiàn)圖1。以是否發(fā)病作為因變量，各基因型為自變量，單因素分析中有顯著意義的密切接觸史和卡介苗接種史為協(xié)變量，進(jìn)行多因素非條件logistic回歸分析。結(jié)果顯示調(diào)整了接觸史和接種史兩個(gè)因素后，IFN-γ基因+874位點(diǎn)基因多態(tài)性與肺結(jié)核的發(fā)生無(wú)顯著性關(guān)聯(lián)(P＞0.05)。將含有等位基因TT和AT組合并，作為參照組AA基因型組與之相比，在病例和對(duì)照組中的分布仍無(wú)差異(P＞0.05)。見(jiàn)表 3。

圖1 IFN-γ基因+874位點(diǎn)基因多態(tài)性

表3 IFN-γ基因多態(tài)性位點(diǎn)與肺結(jié)核易感性的多因素分析

3 討論

人類IFN-γ基因全長(zhǎng)5755 bp，位于常染色體12q14，含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ基因具有6個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，分別位于啟動(dòng)子、內(nèi)含子1、內(nèi)含子3，以及3’端非編譯區(qū)［7］。研究最多的是與第一內(nèi)含子5’末端的(CA)12重復(fù)序列相鄰的+874位點(diǎn)T/A，+874A/T多態(tài)性位點(diǎn)位于轉(zhuǎn)錄因子NF-kappaβ的結(jié)合位點(diǎn)中，且當(dāng)多態(tài)性位點(diǎn)為T(mén)等位型時(shí)，該結(jié)合位點(diǎn)存在［8］。IFN-γ +874T等位序列具有 NF-kappaβ 結(jié)合活性，該結(jié)合對(duì)于IFN-γ的轉(zhuǎn)錄具有調(diào)控作用，使IFN-γ的表達(dá)量呈現(xiàn)出個(gè)體差異。研究表明+874AA和TT基因型分別為低表達(dá)量基因型和 TT為高表達(dá)量基因型［6，8］。同時(shí)，機(jī)體內(nèi)IFN-γ表達(dá)量的高低將直接影響到機(jī)體免疫反應(yīng)效應(yīng)的強(qiáng)弱，進(jìn)而影響到疾病的進(jìn)程及臨床轉(zhuǎn)歸。在結(jié)核感染過(guò)程中，IFN-γ是抗MTB感染的保護(hù)性因子，高表達(dá)量的IFN-γ促進(jìn)巨噬細(xì)胞對(duì)抗原的呈遞和自身的活化，啟動(dòng)機(jī)體的免疫反應(yīng)，從而增加巨噬細(xì)胞清除MTB的活性。

研究表明IFN-γ+874A/T基因型與結(jié)核病的易感性顯著相關(guān)，Lopez-Maderuelo等在對(duì)113例痰菌陽(yáng)性肺結(jié)核、207例健康密切接觸者及100例無(wú)結(jié)核患者接觸史、無(wú)BCG接種史的健康對(duì)照的研究中發(fā)現(xiàn)，攜帶+874AA基因型的個(gè)體患結(jié)核病的危險(xiǎn)性是具有其它基因型個(gè)體的3.75倍［6］。同樣，Sallakci也認(rèn)為攜帶AA基因型的個(gè)體患結(jié)核的危險(xiǎn)性可以增加1.41倍，而攜帶TT基因型的個(gè)體患結(jié)核的危險(xiǎn)性下降至30%［9］。在岡比亞人群［10］、南非人群［11］、克羅地亞人群［12］、巴西人群和印度尼西亞人群［13］中進(jìn)行了大規(guī)模的病例-對(duì)照研究，均證實(shí)了AA基因型別與宿主對(duì)結(jié)核病易感性相關(guān)。然而，另有研究小組在不同人群進(jìn)行的類似研究得出的結(jié)果與之不符，甚至正好與之相反［14］。

本研究利用病例對(duì)照研究將遺傳因素與環(huán)境因素綜合考慮，對(duì)結(jié)核病的危險(xiǎn)因素進(jìn)行了問(wèn)卷調(diào)查，同時(shí)通過(guò)多因素Logistic回歸分析排除其可能引起的混雜影響，從根本上探討IFN-γ+874A/T基因與結(jié)核病易感性的關(guān)聯(lián)。結(jié)果顯示調(diào)整了結(jié)核暴露史和卡介苗接種史兩個(gè)環(huán)境因素后，各基因型在病例和對(duì)照中的分布無(wú)顯著性差異。本研究表明+874A/T基因多態(tài)性與結(jié)核發(fā)病不存在顯著關(guān)聯(lián)。分析人群中IFN-γ基因與結(jié)核病的關(guān)聯(lián)研究上存在差異的原因，可能是由不同的遺傳背景差異或不同的基因-環(huán)境間的交互作用造成，同時(shí)我們也不能排排除由于樣本量差別、研究設(shè)計(jì)差異等客觀因素引起的差異。因此，真正關(guān)聯(lián)有待在不同人群中和更大樣本量基礎(chǔ)上深入研究。

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