鹿連明, 范國成, 胡秀榮, 張利平, 黃振東, 陳國慶*

(1.浙江省柑橘研究所,臺州 318020; 2.福建省農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所,福州 350013)

柑橘黃龍病(huanglongbing,H LB)是柑橘生產(chǎn)上的一種毀滅性病害,廣泛分布在亞洲、非洲、美洲的40多個國家和地區(qū)[1]。其病原物為韌皮部桿菌屬細菌(Candidatus Liberibacter),可分為亞洲種(Ca.L.asiaticus)、非洲種(Ca.L.africanus)和美洲種(Ca.L.americanus)[2],我國的黃龍病病原菌主要為亞洲種[3]。迄今為止該病菌尚不能人工培養(yǎng),在自然條件下主要通過柑橘木虱和嫁接傳播,柑橘植株被侵染后產(chǎn)生復雜多樣的病害癥狀,發(fā)病葉片常表現(xiàn)為均勻黃化、缺素狀和斑駁黃化等,而發(fā)病果實往往變小或畸形,著色不均,橘類常表現(xiàn)為“紅鼻子果”,橙類則表現(xiàn)為果皮青綠、無光澤的“青果”[4]。新樹感病后在1～2年內即死亡,老樹感病后3～5年內死亡或喪失結果能力,嚴重發(fā)生時可造成毀園。

柑橘黃龍病的猖獗危害和蔓延擴散,對柑橘產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定和發(fā)展造成了嚴重的威脅,已經(jīng)成為柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重大障礙。盡管從發(fā)現(xiàn)該病害到現(xiàn)在已有百年的歷史,但目前尚缺乏有效的防治藥劑和理想的抗病品種,主要采取以預防為主的綜合防治的方法來控制其發(fā)生和蔓延,因此,及時了解柑橘植株內黃龍病菌的存在情況,明確病害發(fā)生的原因,對于該病害的有效防控具有重要意義。為此,作者對浙江省臺州市柑橘黃龍病發(fā)生情況進行了調查,并通過常規(guī)和巢式PCR方法,對黃龍病菌在柑橘病株不同部位的分布情況進行了檢測,分析了不同果園內柑橘黃龍病可能發(fā)生的原因,以期為今后該病害的有效防控提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 植物材料

材料A：a果園內‘槾橘’上高接換種為‘本地早’的柑橘植株,表現(xiàn)典型的葉片斑駁黃化和“紅鼻子果”癥狀。材料B：b果園內‘哈姆林’柑橘植株,表現(xiàn)典型的均勻黃化、斑駁黃化和“青果”等癥狀。材料C：a果園內與材料A臨近的未高接換種的‘本地早’、‘槾橘’和‘早橘’植株,未表現(xiàn)柑橘黃龍病癥狀。材料D：b果園內與材料B臨近的‘柳本橙’、‘椪柑’和‘橘柚’植株,大部分枝條或個別枝條表現(xiàn)葉片斑駁黃化癥狀。

1.2 主要試劑

DNA提取試劑如CTAB、酚/氯仿/異戊醇、氯仿/異戊醇 、異丙醇 、PVP、β-巰基乙醇等為 Amersco公司產(chǎn)品。PCR試劑如Taq酶、dNTP等購自大連寶生物公司(TaKaRa)。瓊脂糖為Biowest公司產(chǎn)品。凝膠染料為Biotium公司生產(chǎn)的GelRed。

1.3 引物

設計用于常規(guī)PCR檢測的引物LAP1/LAP2,用于巢式PCR檢測的引物P1/P2和P3/P4,設計好的引物送交TaKaRa公司合成,引物信息見表1。

1.4 柑橘黃龍病的調查分析

于浙江省臺州市不同果園內,現(xiàn)場調查‘少核本地早’、‘溫州蜜柑’、‘椪柑’、‘槾橘’、‘柳本橙’、‘橘柚’等品種的柑橘黃龍病發(fā)生狀況,根據(jù)葉片均勻黃化、缺素狀、斑駁黃化和“紅鼻子果”、“青果”等柑橘黃龍病的病害癥狀,初步了解黃龍病的發(fā)生率和危害程度。并向當?shù)毓r(nóng)了解近幾年該病害的發(fā)生趨勢,結合其發(fā)生現(xiàn)狀,分析病害的發(fā)生規(guī)律及可能的發(fā)病原因。對于病害發(fā)生情況有明顯差異的果園,采集不同柑橘植株和同一柑橘植株不同部位的樣品,帶回室內進行深入的研究確定。

表1 本研究所用的引物

1.5 柑橘樣品總DNA的提取

采用改良的CTAB法提取柑橘樣品材料總DNA：稱取0.1～0.2 g材料于研缽中,加入少量PVP后用液氮研磨成粉末;加入 1～2 ML 2%的CTAB緩沖液及 10～20μLβ-巰基乙醇;將提取液轉移到2 ML的離心管中,于65℃水浴30～60min,期間不時搖動使其充分混勻;加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1),顛倒混勻,12 000 r/min離心10 Min;取上清,加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1),顛倒混勻,12 000 r/min 離心 10 min;取上清,加入等體積預冷的異丙醇,顛倒混勻,-20℃放置30～60Min;12 000 r/Min離心10 Min以沉淀DNA;棄上清,加入適量75%乙醇洗滌沉淀 2次;12 000 r/min離心 10min,吸盡上清,使沉淀于室溫下自然晾干,加入10～20μL TE(含 RNase 50μg/ML)溶解DNA,所得溶液即為樣品DNA溶液。取1μL溶液上樣于0.8%的瓊脂糖凝膠上進行電泳,檢測所提取的DNA質量。

1.6 柑橘植株不同部位黃龍病菌的檢測

取材料A和B的無癥狀葉片中脈、有癥狀葉片中脈、枝條韌皮部、主干韌皮部、砧木韌皮部和根韌皮部,提取樣品總DNA,分別以引物A 2/J5和P1/P2→P3/P4進行常規(guī)和巢式PCR檢測。常規(guī)PCR反應體系為：10×Buffer 2.5μL,dNTPs 2μL,上下游引物(10μmol/L)各 1.5μL,Taq DNA 聚合酶0.2μL,DNA模板 1μL,無菌水補足至總體積25μL。反應條件為94℃5Min,94℃1Min,55℃1min,72℃1 min,35個循環(huán),72℃10min。對于巢式PCR,取1μL第1輪PCR產(chǎn)物為模板,進行第2輪擴增,擴增體系和擴增條件同上。PCR產(chǎn)物上樣于1.5%的預混有GelRed染料的瓊脂糖凝膠上電泳,電泳結束后于凝膠成像儀中觀察拍照。

1.7 不同柑橘植株內黃龍病菌的檢測

分別取材料C和D多個不同柑橘植株的葉片中脈,提取總DNA,分別以引物 A 2/J5和 P1/P2→P3/P4進行常規(guī)和巢式PCR檢測。PCR反應體系和條件同1.5,產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后于凝膠成像儀中觀察拍照。

2 結果與分析

2.1 柑橘黃龍病的發(fā)生狀況

通過調查發(fā)現(xiàn),浙江省臺州市柑橘黃龍病的發(fā)生較為普遍,不同果園不同柑橘品種發(fā)病程度有所差異。很多果園發(fā)病率在5%左右,而發(fā)病嚴重的果園則超過60%,‘椪柑’、‘少核本地早’等品種發(fā)病較重,而橙類等發(fā)病相對較輕。多數(shù)果園(如本研究中的b果園)的發(fā)病率呈逐年遞增的趨勢,即某一處或幾處柑橘植株先發(fā)病,而后以此為中心向周圍逐步擴散至其他植株相繼發(fā)病,單個植株(如材料B)某一個或幾個枝條頂部葉片先表現(xiàn)病害癥狀,之后擴散到其他枝條至整個植株發(fā)病,發(fā)病葉片表現(xiàn)均勻黃化、缺素黃化和斑駁黃化等,果實表現(xiàn)為“紅鼻子果”或“青果”,椪柑果實除表現(xiàn)為“紅鼻子果”外,其中一些形狀轉變?yōu)橹鶢?。而臺州市黃巖區(qū)半洋洪村柑橘果園(a果園)的發(fā)病情況較為特殊,在一年內‘槾橘’高接換種為‘少核本地早’的柑橘植株(材料A)整體發(fā)病,之后病害逐步加重,整株樹表現(xiàn)明顯的斑駁黃化和“紅鼻子果”,而同果園內未高接換種的‘少核本地早’、‘槾橘’和‘早橘’等植株未表現(xiàn)任何病害癥狀。

2.2 黃龍病菌在柑橘植株不同部位的存在情況

以引物 LAP1/LAP2進行的常規(guī)PCR擴增產(chǎn)物為382 bp,以引物 P1/P2→P3/P4進行的巢式PCR擴增產(chǎn)物為400 bp,經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)材料A和B植株不同部位中黃龍病菌的存在情況有所差異(圖1)。在材料A的無癥狀葉片中脈、有癥狀葉片中脈、枝條韌皮部中,及材料B的有癥狀葉片中脈、枝條韌皮部、主干韌皮部、砧木韌皮部中均可檢測到病菌,而在兩種材料的根韌皮部均未檢測到病菌,在材料A的主干韌皮部、砧木韌皮部和材料B的無癥狀葉片中脈也未發(fā)現(xiàn)病菌的存在。

2.3 不同柑橘植株被黃龍病菌感染情況

經(jīng)常規(guī)和巢式PCR檢測,發(fā)現(xiàn)從與材料A同果園內的未高接換種的‘本地早’、‘槾橘’和‘早橘’植株中均擴增不到目的產(chǎn)物,說明這些植株未感染黃龍病菌;而從與材料B同果園內的‘柳本橙’、‘椪柑’和‘橘柚’植株中均可擴增到目的產(chǎn)物,說明這些植株已經(jīng)被病菌感染。檢測結果如圖2。

圖1 柑橘植株不同部位中黃龍病菌的檢測

圖2 不同柑橘植株中黃龍病菌的檢測

3 討論

柑橘黃龍病在自然條件下主要通過柑橘木虱和嫁接傳播,是柑橘生產(chǎn)上防治最難、危害最重、威脅最大的一種病害,目前主要通過加強植物檢疫和培育無病毒苗木來預防,通過消滅田間柑橘木虱和徹底挖除病樹來控制病害的蔓延,因此對該病害快速、準確地檢測并及時了解其發(fā)生規(guī)律和原因對該病害的有效防控至關重要。通過對浙江省臺州市柑橘黃龍病的調查,了解了當?shù)馗涕冱S龍病發(fā)生現(xiàn)狀,并通過常規(guī)和巢式PCR檢測,確定了黃龍病菌在柑橘植株不同部位的存在情況并分析了其發(fā)病原因。對材料B研究發(fā)現(xiàn),病株的有癥狀葉片、枝條、主干和砧木中均含有病菌,無癥狀葉片和根中未檢測到病菌,而其周圍的‘柳本橙’、‘椪柑’和‘橘柚’等植株中也均有病菌的存在。結合材料B的發(fā)病情形,即材料B所在的b果園內最初是幾處柑橘植株先發(fā)病,然后蔓延到周圍其他植株,材料B最初是單個枝梢先表現(xiàn)病害癥狀,而后逐步擴散到其他枝條,至整個植株發(fā)病,分析認為b果園內如材料B等的柑橘植株發(fā)病是由攜帶黃龍病菌的柑橘木虱傳播引起的。對材料A研究發(fā)現(xiàn)病株的無癥狀葉片、有癥狀葉片和枝條中均存在病菌,主干、砧木和根中不含有病菌,而其周圍的未高接換種的‘本地早’、‘槾橘’和‘早橘’植株也未發(fā)現(xiàn)被病菌侵染。結合材料A的發(fā)病情形,即在a果園及同地區(qū)其他類似的果園內‘槾橘’高接換種為‘本地早’的柑橘植株在同一年內整體表現(xiàn)病害癥狀,而同果園內的未高接換種的‘本地早’、‘槾橘’和‘早橘’植株未表現(xiàn)任何癥狀,分析認為諸如a果園內材料A的發(fā)病是由嫁接傳播引起的,即用以高接換種的接穗材料可能本身帶有黃龍病菌,從而導致所有高接換種的柑橘植株整體發(fā)生病害。研究發(fā)現(xiàn),柑橘木虱在病株上取食15Min即可獲得病菌[5],帶菌的木虱在健株上取食5 h即可傳播病菌[6],可見柑橘木虱作為黃龍病菌的媒介昆蟲具有較強的傳播病菌的能力。而嫁接傳播所造成的病害更為嚴重,一旦接穗帶菌,經(jīng)嫁接后的柑橘植株將會在以后成片發(fā)病,并會以此為毒源經(jīng)由柑橘木虱持續(xù)傳播擴散。因此,對于柑橘黃龍病的有效防控,首先要做好預防工作,加強植物檢疫和無病毒苗木的培育,切斷病菌的來源。同時,加強對田間柑橘黃龍病的檢測鑒定,消滅柑橘木虱,徹底挖除病樹,以杜絕病害的持續(xù)擴散。

柑橘植株不同部位黃龍病菌存在的差異表明病菌在植株體內可能存在著一個增殖和擴散的過程。對于柑橘木虱傳播引起的柑橘黃龍病,最先可在木虱取食部位檢測到病菌,之后病菌不斷增殖并擴散到枝條、葉片、主干等部位。胡浩[7]發(fā)現(xiàn)田間柑橘病株內黃龍病菌的表達量呈動態(tài)變化趨勢,10-12月期間病菌含量達到高峰;van Vuuren[8]發(fā)現(xiàn)柑橘木虱傳菌后12個月,可在距接種部位沿樹干40 cm處有黃龍病癥狀表現(xiàn)。對于嫁接傳播引起的柑橘黃龍病,Su和H uang[9]發(fā)現(xiàn)在嫁接接種后的5個月,可在接種幼苗的根部檢測到病菌。胡浩[7]研究發(fā)現(xiàn)柑橘病株的葉片、枝條、主干、果實和種皮等部位均含有黃龍病菌,且含量有較大差異,而在根系中卻沒有檢測到病菌。Lopes和Frare[10]研究發(fā)現(xiàn)嫁接接種4～5個月后,柑橘葉片表現(xiàn)斑駁或缺鐵、缺錳、缺鋅等癥狀,不同品種對黃龍病菌的嫁接傳播效率差異明顯。Folimonova等[11]研究發(fā)現(xiàn)黃龍病菌可在不同品種柑橘植株中增殖,且不同品種對黃龍病菌侵染的反應各異,但植株中病菌的含量與病害的嚴重程度未表現(xiàn)嚴格的相關性,另外,通過嫁接試驗發(fā)現(xiàn)不同品種對黃龍病的嫁接傳播效率無明顯差異,病菌可在較短的時間(4周)內傳播到嫁接后的柑橘植株上。Li等[12]研究發(fā)現(xiàn)不同品種柑橘植株和同植株不同部位中黃龍病菌的含量有所差異,且在有的植株根部可檢測到黃龍病菌而有的未檢測到。Tatineni等[12]在除胚和胚乳外的果實其他部位、樹皮、葉脈及根部均檢測到了黃龍病菌,且不同部位病菌的含量不同,研究還表明黃龍病菌可從嫁接部位逐步擴散到植株的其他部位。而本研究發(fā)現(xiàn)在植株的枝條、主干和砧木等部位檢測到病菌的時候,枝條上一些葉片尚未被病菌侵染。對于發(fā)病情形不同的果園內的兩種柑橘病株,在其根部均未檢測到黃龍病菌,且在嫁接傳播的柑橘病株的主干和砧木中也未發(fā)現(xiàn)病菌。因此,結合前人的研究結果可以看出,柑橘黃龍病菌在柑橘植株中分布不均勻,在不同部位存在病菌的有無和表達量高低的差異。無論對于柑橘木虱傳播還是嫁接接種,病菌在植株體內存在一個增殖和運動的過程,由接種部位開始逐步擴散蔓延到其他部位。對此有必要進行深入研究,明確黃龍病菌的侵染機制及其與寄主的互作關系,以制定對柑橘黃龍病更有效的防控措施。

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