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枸杞子水提物提取工藝優(yōu)化及其對酪氨酸酶活性影響

2011-06-12 06:31:22方繼德
武漢工程大學(xué)學(xué)報 2011年12期
關(guān)鍵詞:水提物枸杞子酪氨酸

劉 戀,黎 莉,方繼德,呂 萌

(武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院,綠色化工過程教育部重點實驗室,湖北 武漢 430074)

0 引 言

枸杞為茄科Solanaceae枸杞屬落葉灌木植物,是我國傳統(tǒng)的藥食兼用的名貴中藥材,主要分布于我國西北地區(qū),其中以寧夏枸杞的應(yīng)用最為廣泛.明朝李時珍在《本草綱目》中記載枸杞具有久服堅筋骨,補精氣諸不足,明目安神,令人長壽等功效[1].現(xiàn)代科學(xué)研究表明,枸杞的藥用和生物活性與其所含的多糖有很大關(guān)系,它具有調(diào)節(jié)免疫、清除自由基、抑制腫瘤、降血脂、降血糖、抗氧化和抗衰老等多方面的作用[2].

酪氨酸酶是皮膚黑色素生成過程中的關(guān)鍵酶,它具有催化酪氨酸并進一步氧化生成黑色素的作用.因此,可以應(yīng)用酪氨酸酶抑制劑來抑制酪氨酸酶的活性,從而阻斷黑色素的合成反應(yīng)鏈[3].而寧夏枸杞水提物顯著的抗氧化活性已得到相關(guān)的研究證明[4].另據(jù)文獻報道,枸杞子水提物的抗氧化活性高于其經(jīng)過純化的多糖,這是因為枸杞子粗提物中含有類胡蘿卜素、核黃素、抗壞血酸、硫氨素和煙酸等,這些物質(zhì)可能也參與了抗氧化反應(yīng)[5];并且在相關(guān)文獻中,還未見枸杞子影響酪氨酸酶活性的報道.因此,本實驗對枸杞子采用水提法進行提取[6],并運用酪氨酸酶氧化法測定枸杞子水提物對酪氨酸酶活性的影響.

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

T6新世紀紫外可見分光光度計,北京普析通用儀器有限公司生產(chǎn);AB204-N型電子分析天平,瑞士Mettler Toledo公司生產(chǎn);TD5-2臺式低速多管架自動平衡離心機,長沙平凡儀器儀表有限公司生產(chǎn);DZ-1BC型真空干燥箱,天津市泰斯特儀器有限公司生產(chǎn).枸杞子購于寧夏銀川市,經(jīng)中南民族大學(xué)萬定榮教授鑒定為茄科植物寧夏枸杞(LyciumbarbarumL.)的干燥成熟果實;無水葡萄糖(分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn),T20090515);熊果苷分析標準品(上海晶純試劑有限公司生產(chǎn),35648);其它試劑均為分析純.

1.2 方法

1.2.1 枸杞子水提物的提取工藝研究a.正交試驗設(shè)計.參考相關(guān)文獻[7],選取料液比A,提取時間B,提取次數(shù)C作為三個考察因素,每個因素選擇三個水平,采用L9(34)正交表進行試驗,以提取所得的枸杞多糖質(zhì)量分數(shù)為指標.因素水平表見表1.b.提取工藝.按表1排定的1號實驗為例,稱取一定量于50 ℃烘干的枸杞子,加10倍量蒸餾水,回流提取1次,每次提取時間為15 min.其余樣品按正交表設(shè)定的條件進行實驗.

表1 因素水平表

1.2.2 枸杞子水提物多糖的質(zhì)量分數(shù)測定a.對照品溶液的配制.精密稱取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖0.025 0 g于250 mL容量瓶中,加水溶解并定容,充分混勻.葡萄糖對照品溶液的濃度為0.1 mg/mL.b.顯色劑的配制.稱取蒽酮0.2 g置于棕色瓶中,再加入100 mL質(zhì)量分數(shù)為95%的濃硫酸,充分溶解后待用.c.標準曲線的繪制.精密吸取5、10、15、20、25 mL葡萄糖對照品溶液0于5個50 mL容量瓶中,加水定容,分別配制濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL的葡萄糖對照品溶液.取5種不同濃度的葡萄糖對照品溶液各2 mL分別置于5支試管中,標號為1、2、3、4、5.再往5支試管中均加入4 mL顯色劑,于100 ℃沸水浴中放置10 min,接著迅速放入冰水浴中冷卻,然后室溫放置8 min.以2 mL水加4 mL顯色劑作為空白對照,在625 nm處測定吸光度[8].以濃度C(mg/mL)為橫坐標,吸光度A為縱坐標,繪制標準曲線,回歸方程為A=55.961C-0.099 8R2=0.999 4.結(jié)果表明多糖濃度在0.003 3~0.016 7 mg/mL之間與吸光度有較好的線性關(guān)系.d.樣品含量測定.將制備的枸杞子水提液經(jīng)室溫冷卻后,于4 000 r/min離心10 min,然后用0.45 μm微孔濾膜過濾器過濾.精密吸取樣品溶液1 mL,置于50 mL容量瓶中,加水定容.再按照“1.2.2”項c中的方法操作,測得的吸光度代入回歸方程中計算樣品的多糖含量.

1.2.3 酪氨酸酶活性影響的測定a.溶液的配制.緩沖液:用磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀配制成pH6.8的磷酸鹽緩沖液;底物溶液:用L-酪氨酸配成濃度為0.1 mg/mL的溶液.酶溶液:稱取適量酪氨酸酶溶于緩沖液中.b.酶活力測定.空白:取L-酪氨酸溶液0.35 mL,加入緩沖液0.4 mL,再加入純凈水0.75 mL;樣品:取L-酪氨酸溶液0.35 mL,加入磷酸鹽緩沖液0.4 mL,再加入純凈水0.25 mL.將空白和樣品均放入30 ℃水浴鍋中,保溫10 min后取出,再往樣品中加入酪氨酸酶溶液0.5 mL,迅速用紫外分光光度計檢測其在317 nm處的吸光度變化,并連續(xù)記錄3 min,得酶促反應(yīng)曲線.c.抑制率測定.將在最佳工藝條件下制備的樣品溶液于50 ℃真空干燥.精密稱取一定量的干燥樣品,分別置于6個容量瓶中,加水定容,配成濃度為0.08、0.26、0.79、1.12、2.24、5.08 mg/mL的6種不同質(zhì)量濃度的樣品溶液.按照“1.2.3”項b中的方法,分別測定這6份樣品溶液對酪氨酸酶的抑制率.以不加樣品液為空白對照,并以熊果苷分析標準品為陽性對照,測定酶相對的剩余活力.枸杞子水提物對酪氨酸酶的抑制率計算公式為:抑制率(%)=(A0-AI)/A0×100%,A0為無抑制劑時的酶活力,AI為有抑制劑時的酶活力.

2 結(jié)果與討論

2.1 正交試驗結(jié)果

正交試驗結(jié)果見表2.從表2得出最佳提取工藝條件為A2B2C3.即在料液比為1∶20,提取時間為30 min,提取次數(shù)為3次的條件下,提取的多糖含量較高.由表2中的極差大小得知影響提取效果的主次因素順序為:A>C>B,即料液比的影響最顯著,其次為提取次數(shù),最后為提取時間.

表2 正交試驗結(jié)果

2.2 酪氨酸酶的酶促反應(yīng)時間曲線

據(jù)文獻報道,在波長317 nm處測定酪氨酸酶活力靈敏度較高[9].由圖1可看出,0~1 min吸光度變化較明顯,曲線上升幅度較大,之后2 min吸光度變化較小,曲線上升趨勢減緩.

圖1 吸光度與時間的關(guān)系曲線

2.3 枸杞子水提物對酪氨酸酶的抑制作用

枸杞子水提物對酪氨酸酶活性的影響見圖2,枸杞子水提物對酪氨酸酶具有明顯的抑制作用,并對酪氨酸酶的抑制效率隨著樣品質(zhì)量濃度的增加而增強.由曲線所得的回歸方程為:Y=-19.482ln(x)+43.890;R2=0.992 4.通過回歸方程計算得出:枸杞子水提物對酪氨酸酶抑制率為50%時的質(zhì)量濃度為0.73 mg/mL.同樣方法測定熊果苷的IC50為0.28 mg/mL.

圖2 抑制率與樣品濃度的關(guān)系曲線

3 結(jié) 語

近年來,國內(nèi)外學(xué)者對枸杞的提取純化、組分分離以及生物活性等方面進行了深入的研究,為枸杞多糖的進一步開發(fā)和利用奠定了基礎(chǔ)[10].然而迄今為止,枸杞仍主要是作為食用保健品被廣泛應(yīng)用.因此,如何根據(jù)現(xiàn)代實驗研究的結(jié)果,并結(jié)合中醫(yī)藥理論知識,對枸杞其它方面的藥理作用進行更加深入地研究,如用于研究色素沉著性皮膚病的治療,還有待進一步地探討.本實驗已證明枸杞子水提物對酪氨酸酶催化酪氨酸形成多巴的過程具有明顯的抑制作用,這將為枸杞子水提物作為一種新型酪氨酸酶抑制劑提供了一定的實驗依據(jù).

參考文獻:

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