蔡光先 藺曉源 易 健 劉柏炎

湖南中醫(yī)藥大學(xué)省部共建中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（湖南長(zhǎng)沙410007）

功能性胃腸病（FGIDs）是一組胃腸綜合征的總稱，多有精神因素的背景，主要為胃腸道的運(yùn)動(dòng)與分泌功能失調(diào)，而在病理解剖方面無(wú)器質(zhì)性病理改變?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為胃腸動(dòng)力障礙是這類疾病的重要發(fā)病機(jī)制之一。人類具有這樣或那樣的情緒體驗(yàn)，是由外部環(huán)境刺激作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)果，并通過(guò)腦腸軸的影響而引起不同的腦腸肽反應(yīng)來(lái)改變胃腸活動(dòng)。神經(jīng)降壓素（NT）和降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）是廣泛分布于胃腸道的兩種重要的腦腸肽，目前大量研究表明其可減緩胃腸道運(yùn)動(dòng)［1-2］。四磨湯是治療FGIDs的有效方劑，臨床和實(shí)驗(yàn)研究證明具有促胃腸動(dòng)力的作用［3-4］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察四磨湯對(duì)慢性應(yīng)激小鼠腦內(nèi)NT、CGRP表達(dá)的影響，探討其調(diào)節(jié)胃腸動(dòng)力的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料（1）動(dòng)物：清潔級(jí)昆明種小鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量（20±2）g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司提供。 （2）藥物：四磨湯口服液（湖南漢森制藥股份有限公司），批號(hào)為091002183，規(guī)格為10mL/支。嗎丁啉（西安楊森制藥公司），批號(hào)為091130529，規(guī)格為10mg/片，用蒸餾水配制成50mg/100mL的藥液備用。（3）試劑：兔抗小鼠NT單抗，由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供，兔抗小鼠CGRP單抗，由武漢博上德生物工程有限公司提供；SP-9000免疫組化染色試劑盒（批號(hào)724944A）和液體AEC酶底物試劑盒（批號(hào)K96914D），由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供；水溶性封片劑，由武漢博士德生物工程有限公司提供。參考文獻(xiàn)［5］制備營(yíng)養(yǎng)性半固體糊，冰箱冷藏，用時(shí)恢復(fù)至室溫。（4）儀器：英國(guó)Thermo公司 E60冰凍切片機(jī)；日本Olympus公司BX-51光學(xué)顯微鏡及Image-Pro Plus 5.1（IPP5.1）圖像分析系統(tǒng)；上海醫(yī)療器械七廠電熱恒溫水浴箱。

1.2 方法（1）分組與造模：所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3d后，隨機(jī)抽取20只作為正常組，其余動(dòng)物開(kāi)始造模，參考文獻(xiàn)［6］并加改進(jìn)，制備不可預(yù)知的慢性應(yīng)激模型，選取多種刺激因素對(duì)大鼠進(jìn)行干預(yù)。①食物剝奪（24h）；②飲水剝奪合并空瓶刺激（12h）；③明暗顛倒（24h）；④濕籠飼養(yǎng)（24h）；⑤強(qiáng)迫游泳 （45℃，5min）；⑥倒懸（30min）；⑦行為束縛（30min）；⑧超聲刺激（2h）；⑨夾尾（1h）。每日隨機(jī)選取1種，相鄰2d的刺激不重復(fù)，連續(xù)刺激21d。各種刺激方法平均使用2～3次，應(yīng)激處理在每日上午08：30開(kāi)始更換。造模成功后，將模型動(dòng)物隨機(jī)分為模型組、嗎丁啉組和四磨湯組，每組20只。（2）給藥：四磨湯組給予四磨湯口服液，嗎丁啉組給予嗎丁啉溶液，模型組給予蒸餾水，灌胃劑量均為7.56mL/（kg·d）（臨床等效劑量），連續(xù)用藥 7d，正常組常規(guī)喂養(yǎng)。（3）小鼠胃排空和小腸推進(jìn)檢測(cè)：給藥第6日，每組隨機(jī)取10只小鼠禁食（自由飲水）24h后末次給藥，給藥后1h灌胃給予半固體糊（0.4mL/只），20min后頸椎脫臼法處死。打開(kāi)腹腔，結(jié)扎幽門(mén)和賁門(mén)，取出胃，用濾紙擦干后稱全質(zhì)量，然后沿胃大彎剪開(kāi)胃體，洗去胃內(nèi)容物后擦干，稱凈質(zhì)量，以胃全質(zhì)量和胃凈質(zhì)量之差為胃內(nèi)殘留物質(zhì)量，計(jì)算胃內(nèi)殘留物占所灌半固體糊質(zhì)量百分比為胃內(nèi)殘留率。同時(shí)迅速取出小腸，測(cè)量黑色半固體糊前沿至幽門(mén)距離（小腸推進(jìn)長(zhǎng)度）和幽門(mén)至回盲部距離（小腸總長(zhǎng)度），按下列公式計(jì)算半固體糊推進(jìn)百分率。推進(jìn)率（%）=黑色半固體糊推進(jìn)長(zhǎng)度/小腸總長(zhǎng)度×100%。（4）小鼠腦組織NT、CGRP表達(dá)檢測(cè)：其余小鼠以10%水合氯醛（4.0mL／kg）麻醉后，開(kāi)顱取腦，4%多聚甲醛固定1h，依次放入15%、20%、30%蔗糖沉底24h。OTC包埋，冰凍切片機(jī)冠狀連續(xù)切片，18μm厚。切片放入3%H2O2去離子水孵育10min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性；PBS洗3min，3次；滴加100μL正常山羊血清室溫孵育 15min，傾去溶液；加入抗 NT、CGRP 小鼠抗體（濃度均為 1∶500），37℃孵育2h，PBS洗 3min，3次；加入 SP-9000生物素化二抗工作液100μL，37℃ 30min，PBS洗 3min，3次； 加入辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液 100μL，37℃ 30min，PBS 洗 3min，3 次：滴加 AEC 顯色劑100μL 10min，雙蒸水充分沖洗以終止染色；貼片，并用水溶性封片劑封片。同時(shí)用正常山羊血清和PBS代替一抗作空白對(duì)照以檢查免疫反應(yīng)的特異性。每張切片置于400倍鏡下隨機(jī)選取陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞不重復(fù)的5個(gè)視野，用IPP5.1圖像分析系統(tǒng)自動(dòng)計(jì)數(shù)免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算其平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS 16.0軟件統(tǒng)計(jì)。資料以（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 四磨湯對(duì)慢性應(yīng)激小鼠胃腸運(yùn)動(dòng)功能的影響模型組小鼠胃排空和小腸推進(jìn)功能降低，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。給藥后，四磨湯組胃內(nèi)殘留率降低，小腸推進(jìn)率升高，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠胃內(nèi)殘留率和小腸推進(jìn)率的比較 （%，±s）

表1 各組小鼠胃內(nèi)殘留率和小腸推進(jìn)率的比較 （%，±s）

與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。 下同。

組 別 n 胃內(nèi)殘留率 小腸推進(jìn)率正常組 10 49.60±8.61△△* 52.04±3.65△△模型組 10 59.20±7.54 44.90±4.61嗎丁啉組 10 50.92±7.59△ 50.25±4.33△△四磨湯組 10 51.15±7.06△ 49.32±4.03△

2.2 四磨湯對(duì)慢性應(yīng)激小鼠腦組織NT表達(dá)的影響NT在正常腦組織中有一定量的表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)紅褐色，主要分布于下丘腦，以星狀、條索狀形態(tài)多見(jiàn)。慢性應(yīng)激后，模型小鼠NT陽(yáng)性細(xì)胞染色較深，數(shù)量較多，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；四磨湯組NT表達(dá)下降，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 見(jiàn)圖 1，表 2。

圖1 各組小鼠腦內(nèi)NT陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)（×400）

表2 各組小鼠腦NT、CGRP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較 （個(gè)/mm2，±s）

表2 各組小鼠腦NT、CGRP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較 （個(gè)/mm2，±s）

組 別 n NT CGRP正常組 10 24.16±2.36△△△ 25.82±2.66△△模型組 10 28.94±2.03 32.04±2.85嗎丁啉組 10 25.00±2.50△ 26.02±2.89△四磨湯組 10 26.24±2.57△△ 26.60±3.08△△

2.3 四磨湯對(duì)慢性應(yīng)激小鼠腦組織CGRP表達(dá)的影響CGRP在正常腦組織的陽(yáng)性表達(dá)呈胞質(zhì)紅褐色染色，不同部位的CGRP表達(dá)形態(tài)多樣，以下丘腦的梭形、多角形多見(jiàn)。模型組CGRP陽(yáng)性細(xì)胞染色深，數(shù)量增多，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；四磨湯組CGRP表達(dá)下降，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。 見(jiàn)圖 2，表 2。

圖2 各組小鼠腦內(nèi)CGRP陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)（×400）

3 討 論

隨著對(duì)心理生物醫(yī)學(xué)模式的深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到中樞在FGIDs發(fā)病中的重要性，神經(jīng)胃腸病學(xué)成為近年來(lái)研究的重點(diǎn)。目前認(rèn)為，F(xiàn)GIDs表現(xiàn)出的動(dòng)力和感覺(jué)功能的障礙，是基于異常的神經(jīng)胃腸病學(xué)基礎(chǔ)，即胃腸動(dòng)力與感知的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)系統(tǒng)的異常，包括神經(jīng)遞質(zhì)的基礎(chǔ)。消化道感染和炎癥與FGIDs發(fā)病的密切關(guān)系構(gòu)成了腦-腸軸調(diào)節(jié)中的周圍環(huán)節(jié)，同時(shí)各種原因引起的心理生理異常是FGIDs腦-腸軸調(diào)節(jié)重要的中樞環(huán)節(jié)［7］。腦腸肽是一類具有神經(jīng)遞質(zhì)和激素雙重功能的小分子多肽，既可作為腸道肽能神經(jīng)釋放的神經(jīng)遞質(zhì)或調(diào)節(jié)介質(zhì)起調(diào)節(jié)作用，也可直接作用于胃腸道感覺(jué)神經(jīng)末梢或平滑肌細(xì)胞的相應(yīng)受體而調(diào)節(jié)腸道的感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)，同時(shí)亦參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)胃腸道的功能［8］。其調(diào)節(jié)功能主要通過(guò)3個(gè)途徑：其一是通過(guò)血液以內(nèi)分泌形式作用于胃腸道細(xì)胞相應(yīng)的受體；其二以腸道肽能神經(jīng)遞質(zhì)形式調(diào)節(jié)胃腸功能；其三由腦腸肽在中樞神經(jīng)系統(tǒng)水平高低的變化來(lái)影響胃腸功能，而下丘腦在胃腸功能的中樞調(diào)節(jié)中起重要作用［9］。

NT是廣泛分布于胃腸道（約85%）和腦（約10%）中的一種腦腸肽。其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要分布于下丘腦和基底前腦，其次為基底節(jié)、腦干，在丘腦和大腦皮質(zhì)分布較少［10］。正常生理情況NT可抑制胃腸運(yùn)動(dòng)和胃、十二指腸、結(jié)腸的機(jī)械運(yùn)動(dòng)。Sako F等［1］研究表明，NT可抑制胃腸道運(yùn)動(dòng)，延緩胃排空。Nightingale JMD等［11］研究發(fā)現(xiàn)，回腸切除術(shù)后的患者由于N細(xì)胞減少，血漿NT水平降低，從而導(dǎo)致液體胃排空加速。CGRP是由37個(gè)氨基酸組成，廣泛分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)及某些非神經(jīng)組織，是腦腸軸發(fā)揮作用的主要中介之一，能從整體水平上調(diào)節(jié)胃腸激素的分泌，抑制胃腸道運(yùn)動(dòng)及對(duì)胃黏膜有保護(hù)作用等，此外CGRP能促進(jìn)胃腸生長(zhǎng)抑素（SS）的釋放。有研究表明［12］CGRP通過(guò)引起胃底縱行肌和胃竇部環(huán)行肌松弛，胃內(nèi)壓降低，進(jìn)而引起胃排空延遲。CGRP能抑制結(jié)腸縱、環(huán)行肌的自主收縮，抑制直腸縱行肌、肛門(mén)內(nèi)括約肌的收縮［13］。

FGIDs屬中醫(yī)學(xué)“胃脘痛”、“痞滿”、“納呆”等范疇，與肝脾功能密切相關(guān)。肝主疏泄而調(diào)暢情志，情志所傷，肝木有病，則氣機(jī)不舒，脾主運(yùn)化受制。四磨湯源于宋代嚴(yán)用和《重訂嚴(yán)氏濟(jì)生方》，全方由木香、枳殼、烏藥、檳榔組成，有順氣降逆、消積止痛之功。臨床上廣泛用于治療功能性消化不良、便秘型腸易激綜合征及非胃術(shù)后胃腸排空障礙等FGIDs療效顯著。

本研究顯示，慢性應(yīng)激模型小鼠胃排空和小腸推進(jìn)功能下降，腦內(nèi)NT和CGRP的表達(dá)明顯增強(qiáng)，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)藥物治療后，四磨湯組小鼠胃腸運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)正常；NT和CGRP的表達(dá)降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與正常組相近。本實(shí)驗(yàn)表明調(diào)節(jié)NT、CGRP的水平變化可能是四磨湯治療FGIDs的作用機(jī)制之一。

［1］Sako F，Marui S，Inatomi N，et al.EM574，an erythromycin derivative，improves delayed gastric emptying of semi-solid meals in consciousdogs［J］.Eur J Pharmacol，2000，395（1）：165-172.

［2］Yong Xuang，Chih Haolee，Sambath，et al.Peroxisome-proliferatoractivated receptor activates fat metabolism to prevent obesity ［J］.Cell，2003，18（113）：159-170.

［3］梁汝堅(jiān)，梁若玲，張繼平.四磨湯口服液治療功能性消化不良45例［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2008，24（6）：1051-1052.

［4］易健，劉杰民，藺曉源，等.四磨湯對(duì)腹部非胃腸手術(shù)后大鼠胃腸運(yùn)動(dòng)的影響［J］.中南藥學(xué)，2010，8（2）：84-86.

［5］李清，高淑麗，王鑫國(guó)，等.越鞠保和丸對(duì)胃排空及胃液分泌的影響［J］.中藥藥理與臨床，2006，22（3）：14-15.

［6］金光亮，南睿，郭霞珍.慢性應(yīng)激肝郁證大鼠模型的建立［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，26（2）：18-21.

［7］柯美云，方秀才.功能性胃腸病研究進(jìn)展與羅馬Ⅲ［J］.胃腸病學(xué)，2006，11（6）：709-712.

［8］沈駿，諸琦，袁耀宗，等.腸易激綜合征患者血漿腦腸肽水平的變化［J］.胃腸病學(xué)，2005，10（5）：290-292.

［9］姜若蘭.胃腸激素與胃腸運(yùn)動(dòng)［J］.中華消化雜志，1996，16（6）：353.

［10］Geisler S，Berod A，Zahm DS，et al.Brain neurotensin，psychostimulants，and stress-emphasis on neuroanatomical substrates［J］.Peptides，2006，27（10）：2364-2384.

［11］Nightingale JMD，Kamm MA，ver der sijp JRM，et al.Gastrointestinal hormones in short bowel syndrome.Peptide YY may be the ”colonic brake to gastric emptying［J］.Gut，1996，39（2）：267-272.

［12］路長(zhǎng)林.神經(jīng)胃腸病學(xué)與動(dòng)力-基礎(chǔ)與臨床［M］.北京：科學(xué)出版社，2005：171-199.

［13］李啟祥，侯曉華.降鈣素基因相關(guān)肽與胃腸運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)：消化系疾病分冊(cè)，2000，20（1）：20-23.