趙 芹，李華平，何自福，佘小曼，謝大森，何曉明，彭慶務(wù)

(1廣東省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所，廣東廣州510640;2華南農(nóng)業(yè)大學植物病毒研究室，廣東廣州510642;3廣東省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，廣東廣州510640)

番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)是世界番茄生產(chǎn)上主要病害之一.該病毒屬雙生病毒科Geminiviridae菜豆金色花葉病毒屬Begomovirus，由煙粉虱 Bemisia tabaci以持久方式傳播［1］.自從1964年發(fā)現(xiàn) TYLCV以來，目前已在中東、東南亞、東亞及非洲等眾多的國家和地區(qū)發(fā)現(xiàn)TYLCV［2］.近年來，在我國廣東、廣西、云南、浙江、江蘇、河南及北京等部分番茄產(chǎn)區(qū)均嚴重流行，并造成了毀滅性危害，其為害癥狀主要表現(xiàn)為葉片卷曲、黃化、黃脈、葉脈增厚、葉背產(chǎn)生耳突及植株矮化，坐果少，果實變小，產(chǎn)量和商品價值均大幅下降，發(fā)病田塊一般減產(chǎn)20% ～30%，嚴重的甚至絕收，給番茄生產(chǎn)造成嚴重損失［3-7］.

廣東番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl Guangdong virus，TYLCGuV)屬單組分菜豆金色花葉病毒屬［3，8-9］，是從廣東黃化曲葉的番茄病株分離鑒定的一個新種，含DNA-A組分，編碼6個基因，同源比較發(fā)現(xiàn)AV1基因編碼外殼蛋白，AV2基因編碼病毒移動相關(guān)蛋白，AC1、AC2與AC3基因分別編碼復(fù)制酶、轉(zhuǎn)錄增強子及復(fù)制增強蛋白，AC4基因鑒定為病毒轉(zhuǎn)錄基因沉默抑制子［3］，但基因編碼的蛋白具體功能還需要進一步驗證與分析.特異性抗血清的制備有助于對TYLCGuV目的蛋白的功能和性質(zhì)進行體內(nèi)外研究，但由于TYLCGuV僅分布于番茄病株的韌皮部，含量偏低，本研究將AC2基因構(gòu)建至原核表達載體，誘導表達了TYLCGuV中AC2基因的融合蛋白，制備了高效價的抗血清，為進一步檢測TYLCGuV及研究AC2基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)與功能奠定了基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

含TYLCGuV-［G3］全長序列的重組質(zhì)粒pMD-G3為廣東省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所蔬菜病害研究室保存;原核表達載體pET-28b(+)、菌株Escherichia coli JM109、Rosetta(DE3)Ⅲ為華南農(nóng)業(yè)大學植物病毒研究室保存;pMD 18-T simple載體、DNA聚合酶、各種限制性內(nèi)切酶為TaKaRa公司產(chǎn)品;增強型HRP底物顯色Western-blotting試劑盒及辣根過氧化酶標記的羊抗兔IgG購自廣州合達生物科技有限公司.

1.2 方法

1.2.1 TYLCGuV-［G3］AC2基因原核表達載體的構(gòu)建 根據(jù)已知的 TYLCGuV-［G3］(登錄號AY602166)AC2基因的序列設(shè)計引物 AC2-P1:5'GGA TCC TAT GCA ACA TTC GTC AC 3'(1 207～1 223 nt)，AC2-P2:5'GTC GAC TTA AAT ACT CTT AAG AAA TG 3'(與1 594～1 614 nt互補)，上游引物引入BamHⅠ酶切位點，下游引物引入SalⅠ酶切位點.以質(zhì)粒pMD-G3為模板，經(jīng)PCR擴增后電泳檢測擴增結(jié)果.切下含目的DNA片段的瓊脂糖凝膠，利用DNA回收試劑盒回收、純化目的DNA片段，將純化產(chǎn)物連接到pMD18-T simple載體中，得到重組質(zhì)粒pST-AC2，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定后進行測序.

將質(zhì)粒pST-AC2和pET-28b(+)分別用BamHⅠ和SalⅠ進行雙酶切，回收目的片段后，利用T4 DNA連接酶進行連接，獲得目的基因的原核表達載體pET-AC2重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定后轉(zhuǎn)化到宿主菌株E.coli Rosetta(DE3)Ⅲ中進行表達.

1.2.2 AC2基因的原核表達 挑取含pET-AC2的E.coli Rosetta(DE3)Ⅲ單菌落，接種到LB液體培養(yǎng)基(含 Kan 50 μg/mL，Cm 34 mg/mL)中，37 ℃下培養(yǎng)至D600nm≈0.6，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，于37℃下誘導表達.含重組質(zhì)粒的宿主菌在終濃度為1 mmol/L IPTG的誘導下表達，分別取誘導時間為1、3、5 和7 h的菌液1 mL，12 000 r/min 離心1 min，收集細菌，用100 μL滅菌蒸餾水重懸，并加入100 μL 2×SDS的凝膠上樣緩沖液，沸水中煮5 min，分別取15 μL上樣，進行SDS-PAGE電泳分析.

1.2.3 AC2表達蛋白抗血清的制備 重組表達載體的宿主菌誘導表達，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，用預(yù)冷的0.25 mol/L KCl染色直至白色蛋白條帶出現(xiàn)，切下目的蛋白條帶加入適量的8.5 g/L NaCl溶液研磨后，與等量福氏完全佐劑混合，乳化作為抗原.取1只2 kg左右雄性健康大耳白兔，注射抗原前取兔耳靜脈血做空白對照血清，然后參考鄧叢良等［10］的方法分別進行皮下多點和肌肉混合注射，共免疫5次，每次各注射1～2 mL乳化抗原溶液，免疫間隔期為7 d，最后1次免疫采用不加佐劑抗原靜脈注射，免疫7 d后耳靜脈采血，測定抗血清效價后心臟采血.

將所采的血室溫放置，待自然凝固后4℃下使凝塊收縮，然后吸取上清液3 000 r/min離心15 min，棄沉淀取上清，加入1 g/L的疊氮鈉，分裝后-20℃下保存.

1.2.4 多克隆抗血清的Western-blotting及ELISA分析 參考吳興泉等［11］的方法，以采集的耳靜脈血間接ELISA測定效價，抗原濃度為免疫注射時的1/20，抗血清稀釋度為1∶32 ～1∶126 872.

取SDS-PAGE電泳后的凝膠，通過電轉(zhuǎn)移法將重組蛋白轉(zhuǎn)印于硝酸纖維素膜上，將目的蛋白的多抗血清稀釋500倍作為一抗，37℃下反應(yīng)0.5 h，洗膜3次，與5 000倍稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG反應(yīng)0.5 h，洗膜，放入預(yù)先配制的底物顯色液(10 mL HRP緩沖液，0.5 mL溶液A，0.5 mL溶液B，0.5 mL溶液C)，室溫避光顯色.

2 結(jié)果

2.1 TYLCGuV-［G3］AC2 基因原核表達載體構(gòu)建結(jié)果

從含TYLCGuV-［G3］AC2基因的質(zhì)粒上擴增到約400 bp的目的片段(圖1)，連接到克隆載體pMD18-T simple載體中，獲得pST-AC2重組質(zhì)粒.重組質(zhì)粒測序結(jié)果表明:目的基因序列與原序列完全一致.利用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切，將其克隆到表達載體pET-28b(+)中，構(gòu)建了目的基因的原核表達載體pET-AC2，酶切鑒定發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒切出預(yù)期大小的條帶，說明重組質(zhì)粒中插入目的片段(圖2).而后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主菌株 E.coli Rosetta(DE3)Ⅲ.

圖1 TYLCGuV-［G3］AC2基因PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 PCR analysis of TYLCGuV-［G3］AC2 gene

圖2 pET-AC2重組質(zhì)粒酶切鑒定電泳分析Fig.2 Analysis of recombinant plasmid pET-AC2 digested by restriction endonuclease

2.2 AC2基因原核表達分析

收集經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導若干小時的含有重組質(zhì)粒的宿主菌E.coli Rosetta(DE3)Ⅲ菌液，以經(jīng)誘導的不含質(zhì)粒和含pET-28b(+)的菌液及未經(jīng)誘導的含重組質(zhì)粒的菌液為陰性對照，進行SDS-PAGE電泳分析.以上產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳分析結(jié)果表明，與陰性對照相比，含pET-AC2質(zhì)粒的菌株經(jīng)1、3、5、7 h誘導后，均可特異性地表達出相對分子質(zhì)量約19 500的目的蛋白，目的蛋白的表達量隨誘導時間的延長并不發(fā)生變化(圖3).

圖3 TYLCGuV-［G3］AC2表達蛋白的SDS-PAGE電泳分析Fig.3 Analysis of TYLCGuV-［G3］AC2 protein by SDS-PAGE

2.3 多抗血清的Western-blotting分析

以制備的多抗血清為一抗進行Western-blotting分析.結(jié)果表明:以純化蛋白制備的抗血清可特異性與重組蛋白反應(yīng)(圖4).間接ELISA測定結(jié)果表明，抗血清稀釋至16 384倍時，仍有明顯的陽性反應(yīng).

圖4 pET-AC2宿主菌表達蛋白的Western-blotting分析Fig.4 Analysis of pET-AC2 protein by Western-blotting

3 討論

傳統(tǒng)抗血清制備中，常以感病的植物組織為材料提純病毒免疫動物.這種方法不僅程序繁瑣，而且由于番茄黃化曲葉病毒在寄主植物組織中含量極低，不易獲得大量高純度的病毒粒子.因此人們常將基因構(gòu)建到原核或真核的表達系統(tǒng)，并在相應(yīng)的宿主中進行表達.由于大腸埃希菌遺傳學和生理學背景清楚，操作簡易，生長周期短，而成為表達許多蛋白的理想工具［12］.在大腸埃希菌里表達外源基因一般始于將目的基因插入表達載體中，轉(zhuǎn)化導入某一合適的菌株中，誘導表達得到目的蛋白.pET系列表達載體，重組插入啟動子下游的目的基因受IPTG誘導調(diào)控，以融合蛋白的形式進行表達.本研究對TYLCGuV-［G3］AC2基因進行原核表達，不僅可簡便快速、低成本制備大量融合蛋白，且表達產(chǎn)物不含寄主植物組織的成分，以此為抗原得到的抗體有較好的?；?，在血清學方法檢測時不易出現(xiàn)假陽性，目前許多植物病毒基因的原核表達產(chǎn)物已廣泛應(yīng)用于植物樣品中病毒的檢測，如水稻黑條矮縮病毒外殼蛋白［13］、大蒜 E 病毒外殼蛋白［14］、蘋果莖痘病毒［15］等.另外，制備的抗血清還可用于蛋白的鑒定、定位和定量分析，研究基因的生物學功能;同時通過復(fù)性獲得具生物活性的目的蛋白，也可為今后開展病毒相關(guān)蛋白的功能研究提供有力的支持.

何自福等［3］對 TYLCGuV-［G3］基因組 DNA-A進行了克隆與序列分析，發(fā)現(xiàn)其具有Begomovirus病毒基因組的典型特征，各基因編碼蛋白與該屬病毒具有較高的氨基酸相似性，故推測AC2基因編碼轉(zhuǎn)錄增強子，但其具體功能及作用機理尚需要進一步研究.本研究成功地對該基因進行了體外表達，并利用其制備了多克隆抗血清;同時，朱艷華等［16］也已成功構(gòu)建了TYLCGuV-［G3］侵染性克隆，在這些研究的基礎(chǔ)上，有望通過侵染性克隆中AC2基因的突變、功能互補等試驗，對AC2結(jié)構(gòu)與功能進行進一步分析.

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