張超賢 郭李柯 郭曉鳳

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 衛(wèi)輝 453100)

食管癌的發(fā)病同多數(shù)惡性腫瘤一樣，是環(huán)境因素與遺傳因素共同作用的結(jié)果，迄今為止，其確切病因尚不清楚。外來化合物一般不能直接起致癌作用，需經(jīng)一系列酶系統(tǒng)代謝活化或轉(zhuǎn)化而成為終致癌物后起作用，有的經(jīng)轉(zhuǎn)化后毒性降低易于排出體外。編碼這些酶的某一些基因具有多態(tài)性，即具有多個等位基因，不同的等位基因編碼的酶活性有差異。代謝酶基因的多態(tài)性可使機體清除外源性致癌物的能力有所不同，導(dǎo)致基因的穩(wěn)定性和細胞的癌變率有所改變，這是決定機體腫瘤易感性的一個重要因素。代謝酶基因多態(tài)性與食管癌易感性的研究日漸增多，目前發(fā)現(xiàn)的與食管癌易感性相關(guān)的代謝酶有細胞色素P450(CYP450)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶(GSTs)、乙醛脫氫酶(ALDH)、亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)等〔1～4〕。為了研究CYP1A1 MspI和ALDH-2在當(dāng)?shù)厝巳褐械姆植紶顟B(tài)，進而探索其和飲酒習(xí)慣相互作用與食管癌高發(fā)的關(guān)系，本研究在國內(nèi)首次開展了CYP1A1 MspI和ALDH-2聯(lián)合基因多態(tài)性與食管癌易感性關(guān)系的研究。

1 對象與方法

1.1 研究對象 2005年3月～2007年4月在我院收治的食管癌患者160例，年齡(54.38±6.92)歲，病理學(xué)確診均為原發(fā)性食管鱗癌或腺癌。對照組160例為健康體檢人群，年齡(53.85±3.42)歲，體檢顯示無腫瘤及遺傳性疾病，兩組在年齡、性別、民族、籍貫統(tǒng)計學(xué)處理差異無顯著性，無血緣關(guān)系，調(diào)查收集研究對象的人口學(xué)資料、吸煙史、職業(yè)史和家族腫瘤史。飲酒狀況由飲酒指數(shù)(DI)來估計，DI表示每日飲酒兩數(shù)×飲酒年數(shù)，本文分為不飲酒、DI≤60者和DI＞60者。每人各抽取靜脈血2～3 ml，置EDTA抗凝管，分離白細胞層。用QIAamp-DNA提取試劑盒(德國QIAgen公司)提取白細胞DNA，DNA置－30℃低溫冰箱保存?zhèn)溆?。兩組臨床資料見表1。

1.2 基因測定

1.2.1 CYP1A1 MspI多態(tài)性分析 引物序列5-CAG TGA AGA GGTGTA GCCGCT-3和5-TAG GAG TCT TGT CTCATGCCT-3，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系總量 25μl，包括 10×緩沖液 2.5μl、1 mmol/L dNTP 2.5 μl、引物各15 pmol、TaqDNA 聚合酶2.5 U、模板 DNA 2 μl，以上試劑購自美國 Promega公司。擴增參數(shù):94℃預(yù)變性4 min，94℃變性 40 s，55℃退火 40 s，72℃延伸 50 s，于美國 PE公司PE480 PCR儀中循環(huán)35次后，72℃延伸7 min。取PCR擴增產(chǎn)物5μl于1.5%瓊脂糖凝膠中，100 V電泳1 h，EB染色30 min，紫外分析儀觀察PCR擴增結(jié)果。電泳板瓊脂糖由大連寶生物工程有限公司生產(chǎn)。取PCR產(chǎn)物10μl，加入MspI內(nèi)切酶(大連寶生物公司)，酶切反應(yīng)體系總量30μl，包括PCR產(chǎn)物 10 μl、10 × 反應(yīng)緩沖液2 μl、MspI內(nèi)切酶10 U，37℃ 3 h。酶切后產(chǎn)物點樣于1.5%瓊脂糖凝膠中，100 V電泳1 h，EB染色30 min，分析結(jié)果。酶切后分為3種基因型:野生型A(m1/m1)為 340 bp，雜合型 B(m1/m2)為 340、200、140 bp，突變純合型 C(m2/m2)為 200、140 bp。見圖 1。

1.2.2 ALDH-2多態(tài)性分析 采用PCR-RFLP引物序列〔2〕:Y3∶5'-CCCTTTGGTGGCTAGAAGATG-3'，Y4∶5-CCACACTCACAGTTTTCTCTT-3'。擴增片段為 91 bp。PCR擴增體系為25 μl，內(nèi)含 1 μl DNA，1 μmol/L 引物，0.25 mmol/L4 × dNTP，0.25 mmol/L MgCl2，1 UTaq酶(購自寶生生物工程有限公司)，以及2.5μl 10×緩沖液。擴增條件為:95℃預(yù)變性10 min，然后進行 35 個循環(huán)(95℃ 1 min，58℃ 2 min，72℃1 min)，最后72℃延伸5 min。擴增后取PCR產(chǎn)物3μl，加入5UMboⅡ限制性內(nèi)切酶(購自寶生生物工程有限公司)及與內(nèi)切酶相配套使用的10×緩沖液，總量為10μl，37℃消化2.5 h。酶切產(chǎn)物的電泳分離與結(jié)果判斷。取酶切產(chǎn)物8μl，作15%聚丙烯酰胺凝膠電泳，EB染色，紫外燈照射，觀察結(jié)果。谷氨酸純合型ALDH12(G/G)-55 bp;谷氨酸賴氨酸雜合型 ALDH1＊22(G/L)-65 bp，55 bp;賴氨酸純合型ALDH22(L/L)-65 bp。見圖2。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件包進行χ2檢驗和Logistic回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 CYP1A1 MspI、ALDH-2基因型分布情況及兩者與食管癌易感性的協(xié)同分析 食管癌組與對照組CYP1A1 MspI(m2/m2)差異有顯著(P＜0.01)，食管癌組與對照組ALDH2(Non-G/G)差異亦有顯著性(P＜0.01);兩者協(xié)同分析顯示，CYP1A1 MspI(m2/m2)/ALDH2(Non-G/G)在食管癌組占31.875%，而對照組僅占6.250%，基因組合CYP1A1 MspI(m2/m2)/ALDH-2(Non-G/G)的食管癌患病比例是CYP1A1 Msp(Non-m2/m2)/ALDH-2(G/G)的9.909倍，兩個基因型之間存在協(xié)同作用。見表 2，表 3。

2.2 食管癌的易感性與飲酒的相關(guān)分析 將正常對照組的飲酒人數(shù)和不飲酒人數(shù)與食管癌組的飲酒人數(shù)和不飲酒人數(shù)進行χ2檢驗，結(jié)果表明食管癌的發(fā)生與飲酒有關(guān)，飲酒者容易患食管癌(OR=3.096，95%CI=1.532 ～4.880，P ＜0.01);食管癌易感性與飲酒指數(shù)相關(guān)分析顯示，高飲酒組較低飲酒組更易患食管癌(OR=6.131，95%CI=3.964～8.315，P ＜0.01)。見表 4，表 5。

2.3 CYP1A1 MspI和ALDH-2基因型和飲酒與食管癌易感性的協(xié)同分析 食管癌組中攜帶CYP1A1 MspI(m2/m2)/ALDH-2(Non-G/G)和飲酒者明顯較對照組多，CYP1A1 MspI(m2/m2)/ALDH-2(Non-G/G)吸煙者占食管癌組的30.000%，而在對照組中僅1.875%，有顯著性差異(P＜0.01);飲酒指數(shù)與CYP1A1 MspI/ALDH-2和食管癌易感性的協(xié)同分析顯示，CYP1A1 MspI(m2/m2)/ALDH-2(Non-G/G)/DI＞60組合的患病比例是CYP1A1 Msp(Non-m2/m2)/ALDH2(G/G)/SI≤60組合的352.500倍。見表6，表7。

表1 食管癌組和對照組的一般資料〔n(%)，n=160〕

表2 兩組CYP1A1 MspI、ALDH-2基因型多態(tài)性分布〔n(%)，n=160〕

表3 CYP1A1 Msp I和ALDH-2基因型與食管癌易感性的協(xié)同分析〔n(%)〕

表4 食管癌易感性與飲酒的相關(guān)性分析〔n(%)，n=160〕

表5 食管癌易感性與DI相關(guān)分析〔n(%)，n=160〕

表6 CYP2E1-RsaI/ALDH 2基因型和飲酒與食管癌易感性的協(xié)同分析〔n(%)，n=160〕

圖1 CYP1A1 PCR產(chǎn)物MspI酶切電泳

圖2 ALDH-2基因PCR產(chǎn)物檢測

表7 CYP2E1-RsaI/ALDH-2基因型和DI與食管癌易感性的協(xié)同分析〔n(%)，n=160〕

3 討論

酒精不是一種致癌劑，而酒精的代謝產(chǎn)物——乙醛卻具有明顯的致癌作用。研究發(fā)現(xiàn)，乙醛是一種肯定性的致癌劑，它與人類腫瘤的發(fā)生存在著一定的關(guān)系〔5〕。乙醛脫氫酶(ALDs)是人體內(nèi)代謝酒精的酶。ALDH-2是由ALDH-2基因編碼，該基因在染色體上的位置為:12q24，由13個外顯子構(gòu)成，編碼的酶蛋白肽鏈由500個氨基酸殘基組成。ALDH-2基因有二個等位基因，把具有催化活性的野生型稱為:ALDH12，催化能力失活的變異型稱為:ALDH22。由于遺傳，在人群中該酶基因型出現(xiàn)3種情況，具有正常催化活性純合子型。ALDH1＊12(G/G);催化活性下降的雜合子型:ALDH1＊22(G/L);催化活性失去的純合子型ALDH2＊22(L/L)。后兩種基因型可引起相應(yīng)的ALDH-2表達缺失或活性降低，導(dǎo)致機體乙醛的集聚，從而增加特定腫瘤發(fā)病率，國內(nèi)外研究證明ALDH-2基因多態(tài)性與多種腫瘤風(fēng)險相關(guān)〔5，6〕。

大多數(shù)環(huán)境致癌物在體內(nèi)都需要代謝激活后才有致癌性，乙醛同樣需要經(jīng)過體內(nèi)I相代謝酶的活化，CYP1A1是重要的I相代謝酶之一，CYP1A1可催化乙醛等外來化合物進人體內(nèi)的I相氧化反應(yīng)，把無活性的前致癌物激活轉(zhuǎn)變?yōu)橛H電子化合物，該親電子化合物可攻擊細胞內(nèi)的生物大分子，與DNA或蛋白質(zhì)形成加合物，最終引起癌基因和抑癌基因的改變，從而導(dǎo)致癌變。CYP1A1基因定位于人類染色體15q 22224，包含7個外顯子和6個內(nèi)含子。CYP1A1的表達受基因的控制和環(huán)境因素的誘導(dǎo)其本底表達和誘導(dǎo)表達水平均有顯著的個體差異。其3'端非翻譯區(qū)的 T6235C置換產(chǎn)生一個 MspⅠ酶切位點即MspⅠ多態(tài)性，突變基因的存在可能是通過與該基因調(diào)節(jié)區(qū)其他多態(tài)性的連鎖而影響CYP1A 1的誘導(dǎo)性。已有研究報道認為Msp I位點的多態(tài)性與喉癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌等腫瘤的易感性有關(guān)〔7，8〕。本研究與上述研究結(jié)果一致。CYP1A 1(m2/m2)基因型者易患食管癌的機制還不清楚，相關(guān)研究均明m2基因型的酶活性高于m1基因型。因此，m2/m2純合子易患食管癌的原因可能是此種基因型者體內(nèi)CYP1A 1活性高，可產(chǎn)生更多的活性致癌物〔9〕。

本研究發(fā)現(xiàn)ALDH-2(Non-G/G)與食管癌的發(fā)生有關(guān)，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，ALDH-2(Non-G/G)與CYP1A 1(m2/m2)對食管癌的發(fā)生有顯著的協(xié)同作用，兼有ALDH-2(Non-G/G)與CYP1A 1(m2/m2)型者食管癌發(fā)生率是兼有ALDH-2(G/G)和CYP1A 1(Non-m2/m2)型食管癌發(fā)生率的9.909倍。此外，本研究發(fā)現(xiàn)飲酒與食管癌的易感性有關(guān)(OR=3.096，95%CI=1.532～4.880，P ＜0.01)。對 CYP1A 1-MspI和ALDH-2基因型與飲酒關(guān)系的協(xié)同分析發(fā)現(xiàn)，在食管癌患者中攜帶CYP1A 1(m2/m2)型基因且飲酒、ALDH-2(Non-G/G)基因型人較對照組多，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗差異有顯著性(P＜0.01)。CYP1A 1(m2/m2)/ALDH-2(Non-G/G)型飲酒者發(fā)生食管癌的危險顯著增加(OR=40.727，95%CI=17.965～66.572)，通過對吸煙狀況分析，發(fā)現(xiàn)大量飲酒者(DI＞60)且具有ALDH-2(Non-G/G)與CYP1A 1(m2/m2)基因型者患食管癌的相對危險度大(OR=352.500，95%CI=229.833～463.317)，對于DI≤60者，ALDH-2(Non-G/G)/CYP1A 1(m2/m2)基因型者患食管癌的風(fēng)險(OR值)為3.750，可以看出，飲酒量越大，時間越長，食管癌患病風(fēng)險越大。

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