高紅偉 劉中浩 邢德國(guó) 王 亮 宮明智

(山東大學(xué)第二醫(yī)院骨外一科，山東 濟(jì)南 250033)

糖尿病因其高發(fā)病率、高致殘率引起世人關(guān)注，而在糖尿病基礎(chǔ)上發(fā)生的骨質(zhì)疏松使患者生活質(zhì)量下降，且容易導(dǎo)致骨折，嚴(yán)重加重家庭及社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松是老年婦女?；嫉囊环N代謝性骨病。絕經(jīng)后的老年糖尿病病人常是糖尿病性骨質(zhì)疏松和絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松并存，此類病人在臨床上較為常見(jiàn)，因此其防治引起了人們的關(guān)注。雌激素、一氧化氮(NO)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1(TGF-β1)已被證實(shí)與骨代謝有關(guān)〔1～4〕。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察糖尿病去勢(shì)大鼠模型中 NO、TGF-β1、雌激素、骨密度的變化，探討糖尿病與絕經(jīng)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的機(jī)制，以及糖尿病與絕經(jīng)在骨質(zhì)疏松發(fā)生上有無(wú)相互作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 鏈脲佐菌素(美國(guó)Sigma公司)，NO試劑盒(南京建成生物研究所)，ELISA試劑盒(德國(guó) DRGGmbH公司)，雙能X射線骨密度測(cè)定儀(美國(guó)NORLAND)，兔抗大鼠TGF-β1單克隆抗體，生物素化山羊抗兔 IgG，TGF-β1SABC試劑盒(武漢博士德公司)，Leica-Qwin計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)(德國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制備 健康清潔級(jí)3月齡雌性Wistar大鼠160只，體質(zhì)量180～200 g，由山東大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。將160只大鼠隨機(jī)分為四組:正常對(duì)照組(A組)，糖尿病模型組(B組)，單純?nèi)?shì)模型組(C組)，糖尿病并發(fā)去勢(shì)模型組(D組)。①糖尿病模型組(B組):隨機(jī)選取3月齡Wistar雌性大鼠80只，腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素60 mg/kg，定向破壞胰島細(xì)胞，3 d后測(cè)血糖高于16.8 mmol/L者為糖尿病大鼠模型制作成功。②單純?nèi)?shì)模型組(C組):隨機(jī)選取3月齡Wistar雌性大鼠40只，腹腔內(nèi)注射1%戊巴比妥鈉30 mg/kg體重，麻醉成功后，將該種動(dòng)物固定，下腹部剪毛，用碘酒、酒精常規(guī)消毒局部，于無(wú)菌條件下取下腹正中切口，長(zhǎng)約1.5 cm，逐層鈍性分離進(jìn)入腹腔，完整切除雙側(cè)卵巢，止血后逐層縫合、關(guān)腹。術(shù)后肌肉注射青霉素2萬(wàn)U/kg共7 d，術(shù)后7 d拆線。③糖尿病并發(fā)去勢(shì)模型組(D組):隨機(jī)選取成模后1 w的糖尿病大鼠模型40只，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行去勢(shì)手術(shù)，方法同②。④正常對(duì)照組(A組):隨機(jī)選取3月齡Wistar雌性大鼠40只，腹腔內(nèi)注射生理鹽水，1 w后行手術(shù)，手術(shù)方式同“去勢(shì)”手術(shù)，不切除卵巢，只切除大網(wǎng)膜脂肪。

1.3 血清雌激素、NO、TGF-β1檢測(cè) 分別于第4，8，12，16周自股靜脈取兩組大鼠血液，高速離心后取血清，放置于-20℃冰箱內(nèi)。采用放免法測(cè)血清雌激素水平;硝酸還原酶法測(cè)血清NO水平;ELISA法檢測(cè)血清TGF-β1水平。

1.4 骨密度(BMD)檢測(cè) 分別于第4，8，12，16周麻醉狀態(tài)下于兩組中各取10只大鼠的右側(cè)股骨，制作病理切片，以雙能X射線骨密度測(cè)定儀檢測(cè)骨密度。

1.5 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)股骨TGF-β1的表達(dá) 采用SABC法進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)步驟按說(shuō)明書(shū)操作。TGF-β1一抗工作濃度為1∶50，棕黃色至深褐色染色為陽(yáng)性染色。應(yīng)用Leica-Qwin計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)在相同灰度閾值設(shè)定條件下，自動(dòng)測(cè)出視野內(nèi)免疫熒光陽(yáng)性染色灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)均以x±s表示，采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，同時(shí)應(yīng)用LSD及Dunnet-t檢驗(yàn)，分析糖尿病及卵巢去勢(shì)兩因素間是否存在相互作用。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清雌激素水平 隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，四組大鼠雌激素水平均逐漸降低。四組相比較，B組與A組差異、C組與D組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，C、D組與A、B組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。A、B兩組雌激素水平各時(shí)間點(diǎn)差異無(wú)顯著性意義，C、D兩組第4和8周、第8和16周差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。LSD及Dunnet-t檢驗(yàn)分析糖尿病與卵巢去勢(shì)對(duì)雌激素影響無(wú)相互作用。見(jiàn)表1。

2.2 大鼠血清NO水平 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，四組大鼠血清NO水平均逐漸降低。四組相比較，B、C、D組與A組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，C組與D組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而C與B、D與B相比，血清NO水平降低更為明顯，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。A組血清NO水平各時(shí)間點(diǎn)差異無(wú)顯著性意義，B、C、D各組第4和8周、第8和16周差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。LSD及Dunnet-t檢驗(yàn)分析糖尿病與卵巢去勢(shì)對(duì)血清NO水平影響無(wú)相互作用。見(jiàn)表2。

表1 大鼠血清雌激素水平(x ±s，n=10，nmol/L)

2.3 大鼠血清TGF-β1水平 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，A、D大鼠血清TGF-β1水平變化不明顯，各時(shí)間點(diǎn)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且兩組相比亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。B組血清TGF-β1水平逐漸升高，各時(shí)間點(diǎn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。C組血清TGF-β1水平逐漸降低，各時(shí)間點(diǎn)亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。B、C與A組相比，差異明顯(P＜0.05)。同樣LSD及Dunnet-t檢驗(yàn)分析糖尿病與卵巢去勢(shì)對(duì)血清TGF-β1水平影響無(wú)相互作用。見(jiàn)表3。

表2 大鼠血清NO水平(x ±s，n=10，μmol/L)

表3 大鼠血清TGF-β1水平(x ±s，n=10，mg/L)

2.4 大鼠股骨BMD水平 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，四組大鼠股骨BMD均逐漸降低。四組相比較，B、C、D組與A組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。C與D、C與B差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而D與B相比，差異明顯(P＜0.05)。A組股骨BMD各時(shí)間點(diǎn)差異無(wú)顯著性意義，B組第4和8周、第8和16周差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，C、D組第8和12周、第12和16周差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。LSD及Dunnet-t檢驗(yàn)分析糖尿病與卵巢去勢(shì)對(duì)股骨骨密度影響無(wú)相互作用。見(jiàn)表4。

2.5 大鼠骨組織中 TGF-β1的表達(dá) A組大鼠骨組織中TGF-β1染色呈陽(yáng)性，主要分布在成骨細(xì)胞胞質(zhì)，部分骨基質(zhì)中也有陽(yáng)性表達(dá)，其陽(yáng)性細(xì)胞染色數(shù)目逐漸下降，但各時(shí)間點(diǎn)差異無(wú)顯著性意義(P＞0.05)。而B(niǎo)、C、D三組骨組織中TGF-β1的表達(dá)范圍未變，但各時(shí)間點(diǎn)陽(yáng)性細(xì)胞染色數(shù)目下降明顯，甚至不表達(dá)，與A組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，表達(dá)明顯降低(P＜0.01)。C與D、C與B相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而D與B相比，差異明顯(P＜0.05)。LSD及Dunnet-t檢驗(yàn)分析糖尿病與卵巢去勢(shì)對(duì)局部骨組織中TGF-β1的表達(dá)無(wú)相互作用。見(jiàn)表5、表6。

表4 大鼠股骨BMD水平(x ±s，n=10，g/cm2)

表5 大鼠骨組織中TGF-β1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)水平(x ± s，n=10)

表6 大鼠骨組織TGF-β1灰度值水平(x ± s，n=10)

3 討論

骨質(zhì)疏松是一種系統(tǒng)性骨骼疾病，是導(dǎo)致骨折的重要原因。糖尿病可導(dǎo)致多個(gè)系統(tǒng)的病變，能影響骨代謝引起骨質(zhì)疏松，雌激素缺乏也被認(rèn)為是老年婦女出現(xiàn)骨質(zhì)疏松的主要原因。而臨床上常見(jiàn)到絕經(jīng)后糖尿病病人，他們常同時(shí)存在糖尿病性骨質(zhì)疏松和絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松。有研究認(rèn)為某些細(xì)胞因子會(huì)影響骨代謝，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生〔5，6〕。

雌激素通過(guò)作用于成骨細(xì)胞上的雌激素受體，改善骨的代謝，減少骨的吸收，它還可抑制甲狀旁腺介導(dǎo)的骨吸收并增加腸道和腎臟對(duì)鈣的重吸收，升高血鈣水平，促進(jìn)骨的形成〔1〕。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明去勢(shì)仍是雌激素降低的主要因素，糖尿病對(duì)雌激素影響較小，當(dāng)兩因素同時(shí)存在時(shí)，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示兩者無(wú)相互作用。

NO廣泛存在于機(jī)體的各種組織中，能誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的凋亡，抑制成熟破骨細(xì)胞的活性，減少骨吸收〔2〕。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明糖尿病、卵巢去勢(shì)均可影響血清NO水平，使其降低。有研究顯示NO與BMD有關(guān)〔3〕，并通過(guò)降低對(duì)破骨細(xì)胞活性的抑制作用，增強(qiáng)骨吸收，導(dǎo)致BMD降低，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其相符。研究提示在去卵巢大鼠中，雌激素水平降低，可導(dǎo)致NO水平下降，減輕對(duì)破骨細(xì)胞活性的抑制，增加骨吸收〔4〕，導(dǎo)致BMD減低，本實(shí)驗(yàn)中卵巢去勢(shì)組及糖尿病并發(fā)去勢(shì)組的結(jié)果與其相符。但本實(shí)驗(yàn)提示糖尿病骨質(zhì)疏松中可能存在其他機(jī)制導(dǎo)致NO降低。本實(shí)驗(yàn)推測(cè)糖尿病、卵巢去勢(shì)兩因素對(duì)血清NO水平具有疊加作用，也從另一角度支持了Undurti的研究。

TGF-β1在機(jī)體中廣泛存在，尤其在骨組織中含量最為豐富。TGF是一類對(duì)靶細(xì)胞具有多種特殊作用的細(xì)胞生長(zhǎng)和分化調(diào)節(jié)蛋白。TGF-β1在不同條件下，既可促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，又可降低其分化;而且還可支持破骨細(xì)胞形成，刺激骨的吸收;它是骨形成和骨吸收之間重要的偶聯(lián)調(diào)節(jié)因子〔7〕。TGF-β1可以促進(jìn)雌激素受體表達(dá)，增強(qiáng)雌激素抑制骨丟失的功能〔8〕;雌激素減少亦可通過(guò)直接作用于骨細(xì)胞引起TGF-β1分泌減少。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠血清TGF-β1逐漸升高，與正常組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與Mather等〔9〕實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，他認(rèn)為血清TGF-β1升高可能和高血糖、腎臟代謝以及RAS系統(tǒng)有關(guān);單純卵巢去勢(shì)組血清TGF-β1降低，與正常組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這和既往研究相符〔10〕。另外，TGF-β1在對(duì)照組骨組織中呈陽(yáng)性染色，主要分布在成骨細(xì)胞胞質(zhì)，部分骨基質(zhì)中也有表達(dá)，說(shuō)明TGF-β1在正常情況下參與了骨代謝平衡的維持。而TGF-β1在糖尿病、卵巢去勢(shì)組大鼠骨組織中表達(dá)較弱，說(shuō)明糖尿病、卵巢去勢(shì)均影響骨組織中TGF-β1的表達(dá)，導(dǎo)致骨代謝失衡。對(duì)實(shí)驗(yàn)中血清TGF-β1水平、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及灰度值的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，未發(fā)現(xiàn)糖尿病與卵巢去勢(shì)有相互作用，但根據(jù)各指標(biāo)結(jié)果，我們?nèi)酝茰y(cè)糖尿病及卵巢去勢(shì)間存在疊加作用，并推測(cè)糖尿病及卵巢去勢(shì)不存在影響TGF-β1的共同徑路，可能是通過(guò)不同途徑影響骨組織中TGF-β1的結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)中，糖尿病組、單純?nèi)?shì)組及糖尿病并發(fā)去勢(shì)組大鼠股骨BMD均降低，與正常組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且糖尿病與卵巢去勢(shì)對(duì)股骨骨密度的影響沒(méi)有協(xié)同或拮抗作用，但兩因素同時(shí)存在時(shí)骨密度降低較大，推測(cè)糖尿病與卵巢去勢(shì)對(duì)骨密度的影響存在疊加作用。TGF-β1被證實(shí)與骨代謝有關(guān)，TGF-β1基因缺失可導(dǎo)致骨密度降低，同樣NO也被證實(shí)可促進(jìn)骨形成，抑制骨吸收，增加eNOS基因的表達(dá)或提供外源性NO均可導(dǎo)致骨密度升高〔11，12〕，這和本實(shí)驗(yàn)結(jié)果均相符。但是 NO，TGF-β1在骨質(zhì)疏松的發(fā)生機(jī)制中是否有相互作用，在糖尿病及卵巢去勢(shì)的干預(yù)下導(dǎo)致骨密度降低的原理仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

綜上所述，糖尿病、卵巢去勢(shì)以及兩者同時(shí)存在時(shí)均能夠引起大鼠骨密度降低，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。糖尿病及卵巢去勢(shì)對(duì)血清NO、血清TGF-β1、骨組織TGF-β1及骨密度的影響無(wú)明顯的相互作用，但根據(jù)結(jié)果數(shù)據(jù)，我們推測(cè)兩者對(duì)上述指標(biāo)的影響存在疊加作用。即糖尿病與卵巢去勢(shì)同時(shí)存在時(shí)，骨密度降低幅度更大，可出現(xiàn)更嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松。

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