倪振華 陳 果 陳清閣 王雄彪▲

1.上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院實驗中心，上海 200062；2.上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院呼吸科，上海 200062

支氣管哮喘是一種常見病，其患病率不低，并有逐漸增高的趨勢[1]。第10號染色體上磷酸酶和張力蛋白同源缺失的基 因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）是近年來新發(fā)現(xiàn)的一個與哮喘發(fā)病相關(guān)的基因[2]，目前已證明在OVA誘發(fā)的哮喘大鼠模型中，PTEN蛋白表達和活性均降低，而給予糖皮質(zhì)激素地塞米松治療能促進PTEN的表達，抑制炎性細胞因子的分泌[3]。但是目前關(guān)于PTEN基因與哮喘的發(fā)病關(guān)系以及地塞米松對其的調(diào)節(jié)研究主要集中在哮喘動物上，盡管PTEN基因在人和鼠中高度同源，但是否在哮喘患者中也存在類似的關(guān)系，目前與此相關(guān)的研究國內(nèi)外尚無報道。因此本研究擬通過測定哮喘患者和非哮喘患者氣道黏膜組織中PTEN基因的表達變化，探討PTEN在人哮喘發(fā)病中的關(guān)系，通過采用人氣道上皮細胞A549探討地塞米松對PTEN的表達調(diào)節(jié)，揭示地塞米松治療哮喘的新途徑。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2010年6月～2011年6月上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院收住院的5例支氣管哮喘患者作為研究對象，其中男4例，女1例，年齡30～45歲，均符合中華醫(yī)學(xué)會制定的支氣管哮喘診斷標準，所有患者于入選前1個月內(nèi)均未使用糖皮質(zhì)激素治療。正常對照組選取住院的非哮喘患者，其中男4例，女2例，年齡30～45歲。氣道黏膜組織取自支纖鏡黏膜活檢。

1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒購購自Qiagen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Invitrogen公司，引物和探針由上海閃晶公司合成，熒光定量PCR試劑購自Roche公司。人氣道上皮細胞A549購自中科院細胞所。地塞米松購自上海醫(yī)藥（集團）有限公司信誼制藥總廠。

1.3 方法

1.3.1 熒光定量PCR檢測PTEN基因的表達 RNA 的提取采用Qiagen公司的RNeasy Micro Kit 試劑，按說明書操作方法進行。cDNA合成采用Invitrogen公司SuperScript Ⅲ第一鏈合成試劑盒，按說明書操作方法進行。熒光定量PCR反應(yīng)試劑采用 Roche公司 PCR master mix，反應(yīng)條件為：94℃ 10 min，94℃30 s，60℃ 1 min，共40個循環(huán)，ABI7300全自動熒光定量PCR儀（美國ABI公司），以GAPDH基因作為內(nèi)參，引物和探針序列 如 下：PTEN-F 5- GGGACGAACTGGTGTAATGATATG-3；PTEN-R 5- ATAGCGCCTCTGACTGGGAATAG-3；PTEN-Probe 5-fam- CCCTTTTTGTCTCTGGTCCTTACTTCCCC-tamra-3；GADPH-F 5- CCACTCCTCCACCTTTGAC-3；GADPH-R 5- ACCCTGTTGCTGTAGCCA -3；GADPH-Probe：5-fam- TTGCCCTCAACGACCACTTTGTC-tamra-3。

1.3.2 細胞培養(yǎng) 人氣道上皮細胞A549用RPMI-1640培養(yǎng)液（含10%小牛血清），在37℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)，隔天換液。取對數(shù)生長期細胞，用1640培養(yǎng)基制成細胞懸液 （1×l06個/mL ）加入6孔板，2 mL/孔，培養(yǎng)24 h后給不同濃度的地塞米松處理。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用REST-XL軟件和統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS11.0作為基因表達的相對定量統(tǒng)計學(xué)分析[4]，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTEN基因在哮喘患者中的表達情況分析

本實驗共提取5例哮喘患者和6例非哮喘患者氣道黏膜組織的RNA，采用熒光定量PCR檢測了PTEN基因的表達情況，實驗結(jié)果通過REST軟件分析顯示PTEN基因在哮喘患者中的表達低于非哮喘患者（下降3.784倍），兩組的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05）。

2.2 地塞米松對PTEN的表達調(diào)節(jié)

分別采用不同濃度的地塞米松（10-5M、10-6M、10-7M和 10-8M）處理A549細胞24 h，提取RNA后采用熒光定量PCR檢測PTEN基因的表達情況，結(jié)果顯示地塞米松能上調(diào)PTEN基因的表達水平，呈濃度依賴性（P＜0.01，圖1A）。再以10-5M濃度的地塞米松分別處理A549細胞24、48、72和96 h，結(jié)果顯示隨著地塞米松處理時間的延長，PTEN基因的表達逐步上升，具有一定的時間依賴性（P＜ 0.01，圖 1B）。

圖1 地塞米松處理A549細胞對PTEN表達的影響，A：不同濃度的地塞米松（10-5M、10-8M）處理A549細胞24 h；B：10-5M濃度的地塞米松處理A549細胞24～96 h。與對照組比較，*P ＜0.01

3 討論

第10號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白基因（PTEN）是于1997年發(fā)現(xiàn)的一個具有磷酸酶活性的抑癌基因，研究發(fā)現(xiàn)PTEN不僅與肺癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，與其他呼吸系統(tǒng)疾病，如支氣管哮喘等也有一定關(guān)系。在卵蛋白（OVA）誘發(fā)的哮喘小鼠模型中，PTEN蛋白表達和活性均降低。在給予PI3K抑制劑或PTEN腺病毒cDNA后，可明顯減少氣道炎癥[2]，即上調(diào)PTEN表達能治療哮喘。在過敏原誘發(fā)的哮喘小鼠模型給予PPAR-r促效劑或PPAR-r腺病毒后，PTEN表達上調(diào)。通過測量Akt磷酸化水平的減少發(fā)現(xiàn)該上調(diào)與PI3K活性降低有關(guān)[5]。該實驗表明PPAR-r在哮喘發(fā)病學(xué)中，通過調(diào)節(jié)PTEN表達而起到保護作用。本實驗結(jié)果顯示在哮喘患者的氣道黏膜組織中PTEN的表達也是下調(diào)的，與動物實驗的結(jié)果一致，進一步說明PTEN在哮喘發(fā)病中發(fā)揮了重要作用，PTEN可以作為哮喘治療靶點之一。

糖皮質(zhì)激素地塞米松在治療哮喘方面的一線作用已毋庸置疑，其可抑制多種炎癥細胞的活化和炎癥因子的生成及釋放，降低血管通透性，提高β2受體的敏感性，對于哮喘的急性炎癥及慢性氣道重塑都有肯定的療效。研究發(fā)現(xiàn)地塞米松治療哮喘大鼠后，PTEN表達明顯上調(diào)，提示地塞米松可能通過調(diào)節(jié)PTEN的表達從而發(fā)揮哮喘治療的作用。本實驗也在人氣道上皮細胞上證實地塞米松能上調(diào)PTEN的表達，本研究結(jié)果顯示地塞米松治療哮喘的新途徑。

綜上所述，通過檢測哮喘動物和哮喘患者中PTEN基因的表達情況揭示了PTEN在哮喘發(fā)病機制中的重要作用，正向調(diào)控PTEN可能是哮喘治療的新途徑。

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